체외 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 이용한 트리파노소마 크루지 의 모든 생애주기 단계에 대한 약물 스크리닝
Summary
우리는 Chagas 질병의 원인 인자 인 Trypanosoma cruzi의 세 가지 수명주기 단계에서 β-galactosidase 활성을 측정하는 고처리량 비색 분석을 설명합니다. 이 분석은 트립파노시달 화합물을 쉽고 빠르며 재현 가능한 방식으로 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
트리파노소마 크루 지는 라틴 아메리카에서 공중 보건이 중요한 발병 질환인 샤가스병(ChD)의 원인균으로, 이주의 증가로 인해 많은 비발병 국가에도 영향을 미친다. 이 질병은 거의 8 백만 명의 사람들에게 영향을 미치며 새로운 사례는 연간 50,000 명으로 추산됩니다. 1960 년대와 70 년대에는 ChD 치료를위한 두 가지 약물, 즉 nifurtimox와 benznidazole (BZN)이 도입되었습니다. 둘 다 신생아와 질병의 급성기에는 효과적이지만 만성기에는 효과적이지 않으며 그 사용은 중요한 부작용과 관련이 있습니다. 이러한 사실은 T. cruzi에 대한 신약 검색을 강화할 긴급한 필요성을 강조합니다.
T. cruzi 는 Reduviidae 및 Hemiptera 가족의 hematophagous 곤충 벡터를 통해 전달됩니다. 일단 포유동물 숙주에 들어가면, 편모가 없는 아마스티고테 형태로서 세포내 증식하고, 트립포마스티고테, 혈류 비복제성 감염 형태로 분화된다. 곤충 벡터 내부에서, trypomastigotes는 epimastigote 단계로 변형되고 이진 분열을 통해 증식합니다.
본 논문은 기질인 클로로페놀 레드β-D-갈락토피라노사이드(CPRG)를 이용하여 기생충 용해로 인한 배양물 내로 방출된 세포질 β-갈락토시다제의 활성을 측정하는 것에 기초한 검정을 설명한다. 이를 위해, T. cruzi Dm28c 균주를 β-갈락토시다아제-과발현 플라스미드로 형질감염시키고, 에피마스티고테, 트리포마스티고테 및 아마스티고테 단계에서 시험관내 약리학적 스크리닝에 사용하였다. 이 논문은 또한 예를 들어 참조 약물인 벤즈니다졸을 사용하여 배양된 에피마스티고트, 아마티고트로 감염된 베로 세포, 및 트리포마스티고트에서 효소 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 이 비색 분석은 쉽게 수행되며 고처리량 형식으로 스케일링하고 다른 T. cruzi 균주에 적용할 수 있습니다.
Introduction
샤가스병(ChD) 또는 미국의 트리파노소마증은 편모 원생동물인 트리파노소마 크루지(T. cruzi)에 의해 유발되는 기생충 질환이다. ChD는 일반적으로 진단되지 않은 무증상 또는 올리고 증상 급성기로 시작하여 평생 만성 단계가 뒤 따릅니다. 만성적으로, 환자의 ~ 30 %는 감염 후 수십 년 후에 나타납니다 – 심근 병증, 메가 소화 증후군 또는 둘 다를 포함한 다양한 쇠약 한 상태가 나타나며 사망률은 0.2 %에서 20 % 1,2,3 사이입니다. 무증상 만성 환자는 임상 징후가 없지만 평생 동안 혈청 양성으로 남아있을 수 있습니다.
추정에 따르면 전 세계적으로 약 7 백만 명의 사람들이 ChD가 풍토병이있는 라틴 아메리카에서 주로 감염되었습니다. 이들 국가에서 T. cruzi 는 주로 감염된 피를 빨아 먹는 트리아토민 벌레 (벡터 매개 전염)를 통해 전염되며 기생충을 포함하는 트리아토민 배설물로 오염 된 음식의 섭취를 통한 경구 전달에 의해 덜 빈번합니다2. 또한, 기생충은 chagasic 어머니에서 신생아로, 수혈을 통해 또는 장기 이식 중에 태반을 통해 전염 될 수 있습니다. 감염 및 인간 이동을 획득하는 이러한 벡터 독립적 인 방법은 북미, 유럽 및 일부 아프리카, 동부 지중해 및 서태평양 국가에서 점점 더 많은 사례에 의해 입증 된이 질병의 전 세계적인 확산에 기여했습니다4. ChD는 벡터 매개 전염이 빈곤과 밀접한 관련이 있으며 특히 라틴 아메리카 저소득 국가에서 주요 공중 보건 문제이기 때문에 방치 된 질병으로 간주됩니다. 이용 가능한 치료법이 있지만 라틴 아메리카의 ChD로 인한 사망률은 말라리아2를 포함한 기생충 질환 중에서 가장 높습니다.
1960 년대 후반과 1970 년대 초에 도입 된 ChD 치료에 등록 된 두 가지 약물이 있습니다 : nifurtimox와 benznidazole5. 두 약물 모두 성인, 어린이 및 선천적으로 감염된 신생아뿐만 아니라 만성 감염이있는 어린이뿐만 아니라 치료가 일반적으로 이루어지는 어린이의 급성 단계에 효과적입니다. 그러나 소수의 사람들 만이 제 시간에 치료할 수있을만큼 일찍 진단됩니다. 최신 임상 시험에 따르면, 두 약물 모두 성인에게 중요한 한계가 있으며 만성 질환을 앓고있는 사람들의 증상을 줄이는 데 효과적이지 않았습니다. 따라서이 단계에서 그들의 사용은 논란의 여지가 있습니다. 다른 단점은 장기간 치료 기간 (60-90 일)과 빈번하고 심각한 부작용이 관찰되어 감염된 사람 6,7의 비율에서 치료를 중단하게됩니다. ChD 환자의 10 % 미만이 진단을 받았으며 많은 영향을받는 사람들이 의료 서비스에 대한 접근성이 없거나 부족한 농촌 지역에 살고 있기 때문에 치료에 접근 할 수있는 사람은 훨씬 적습니다8. 이러한 사실은 특히 만성 단계에 대해보다 효율적이고 안전하며 적용 가능한 현장 치료를 허용하기 위해 T. cruzi에 대한 신약을 찾아야 할 긴급한 필요성을 강조합니다. 이와 관련하여, 보다 효과적인 화합물의 개발에서 또 다른 과제는 시험관내 및 생체내9에서 약물 효능을 평가하기 위한 시스템의 제한이다.
잠재적 약물 표적의 확인을 위한 화학 생물학 및 게놈 접근법이 키네토플라스티드 기생충에서 사용되었지만, T. cruzi 에서 사용 가능한 게놈 도구는 T. brucei 또는 Leishmania와는 대조적으로 제한적이다. 따라서, 트립파노시드 활성을 갖는 화합물의 스크리닝은 ChD에 대한 새로운 화학요법 약물 후보물질을 찾는 데 여전히 가장 많이 사용되는 접근법이다. 보통, T. cruzi 에서의 약물 발견은 에피마스티고테 단계에 대한 시험관내 분석에서 신약의 효과를 시험하는 것으로 시작해야 한다. 수십 년 동안 T. cruzi 에 대한 후보 화합물의 억제 효과를 측정하는 유일한 방법은 수동 현미경 계수였으며, 이는 힘들고 시간이 많이 걸리며 운영자에 따라 다릅니다. 더욱이, 이 접근법은 적은 수의 화합물을 어세싱하는 데 적합하지만 큰 화합물 라이브러리의 고처리량 스크리닝에는 허용되지 않는다. 요즘 많은 조사는 시험관 내에서 분석 된 다양한 기원의 방대한 수의 화합물을 분석하여 기생충 성장을 억제하는 능력을 테스트하는 것으로 시작됩니다. 비색 및 불소 방법 모두 이러한 분석에서 처리량을 증가시켜 스크리닝의 객관성을 향상시키고 전체 프로세스를 덜 지루하게 만들기 위해 개발되었습니다9.
가장 널리 사용되는 비색 방법 중 하나는 Bucknet 및 공동 작업자(10)에 의해 처음 설명 된 형질감염된 기생충의 β-갈락토시다제 활성에 기초한다. 재조합 기생충에 의해 발현되는 β-갈락토시다제 효소는 발색성 기질인 클로로페놀 레드 β-D-갈락토피라노시드(CPRG)를 클로로페놀 레드로 가수분해하며, 이는 마이크로플레이트 분광광도계를 이용하여 비색적으로 쉽게 측정할 수 있다. 따라서, 다양한 화합물의 존재하에서의 기생충 성장은 마이크로타이터 플레이트에서 동시에 평가되고 정량될 수 있다. 이 방법은 epimastigote 형태 (곤충 벡터에 존재), trypomastigotes, 및 기생충의 포유동물 단계 인 세포 내 amastigotes에서 약물을 시험하기 위해 적용되었습니다. 또한, 에스케리치아 콜라이 β-갈락토시다제 효소를 발현하기 위해 pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 플라스미드(pLacZ)10으로 형질감염된 몇몇 재조합 T. cruzi 균주가 이미 이용가능하고(그리고 새로운 것들이 구축될 수 있음), 이는 동일한 화합물10,11,12,13에 대해 동등하게 행동하지 않을 수 있는 상이한 이산 타이핑 유닛(DTU)으로부터의 기생충의 평가를 허용한다. . 이 방법은 저처리량 및 고처리량 스크리닝12,13에서 T. cruzi에 대한 화합물에 대한 활성을 평가하기 위해 이미 성공적으로 사용되었다. 유사한 접근법이 Toxoplasma gondii 및 Leishmania mexicana14,15를 포함한 다른 원생 동물 기생충에서도 사용되었습니다.
이 논문은 β-갈락토시다제를 발현하는 기생충을 사용하여 T. cruzi의 모든 수명주기 단계에 대한 시험관내 약물 스크리닝을 위한 상세한 방법을 설명하고 보여준다. 여기에 제시된 검정은 DTUI13으로부터 T. cruzi Dm28c 균주를 pLacZ 플라스미드 (Dm28c/pLacZ)로 형질감염시킴으로써 수득된 β-갈락토시다아제-발현 T. cruzi 라인으로 수행되었다. 추가적으로, 동일한 프로토콜은 화합물 사이의 성능과 T. cruzi 균주 또는 DTU 사이의 성능을 비교하기 위해 다른 균주에 쉽게 적응될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 기질 CPRG의 존재하에 T. cruzi epimastigotes, trypomastigotes, 또는 amastigotes로 감염된 세포의 막 용해로 인해 방출되는 세포질 β-갈락토시다제 활성을 결정하는 것에 기초한 검정을 기술한다. 우리는 T. cruzi Dm28c / pLacZ 기생충을 사용했는데, 이는 Buckner와 공동 저자10에 의해 구축 된 β 갈락토시다제 함유 플라스미드로 형질 감염 후 얻은 안정한 기생충 균주입니다. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pLacZ 플라스미드를 친절하게 제공해 주신 Buckner 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, 아르헨티나의 Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) 및 영국 연구위원회 [MR / P027989 / 1]가 지원했습니다. Servier Medical Art는 도 1( https://smart.servier.com)을 제작하기 위해 사용되었다.
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
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