भ्रूणीय जोड़तोड़ जैसे कि कोशिकाओं का निष्कासन और प्रत्यारोपण प्रारंभिक विकास का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यह प्रोटोकॉल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में इन जोड़तोड़ को करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रत्यारोपण उपकरण का वर्णन करता है।
शास्त्रीय भ्रूणीय जोड़तोड़, जैसे कोशिकाओं को हटाना और भ्रूण के भीतर या उसके बीच कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना, जटिल विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली तकनीकें हैं। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण आदर्श रूप से इन जोड़तोड़ के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि वे आसानी से सुलभ, आकार में अपेक्षाकृत बड़े और पारदर्शी हैं। हालांकि, सेल हटाने और प्रत्यारोपण के लिए पहले से विकसित उपकरण उपयोग करने के लिए बोझिल हैं या खरीदने के लिए महंगे हैं। इसके विपरीत, यहां प्रस्तुत प्रत्यारोपण उपकरण किफायती, इकट्ठा करने में आसान और उपयोग करने में आसान है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले प्रत्यारोपण डिवाइस के साथ-साथ व्यावसायिक और व्यापक रूप से उपलब्ध भागों से इसकी असेंबली को संभालने का परिचय देते हैं। फिर हम इसके उपयोग के लिए तीन अनुप्रयोगों को प्रस्तुत करते हैं: स्थानीयकृत स्रोतों से सिग्नल फैलाव का अध्ययन करने के लिए अस्थानिक क्लोन की पीढ़ी, आकार-कम भ्रूण का उत्पादन करने के लिए कोशिकाओं का निष्कासन, और मातृ-युग्मनज उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए जर्मलाइन प्रत्यारोपण। अंत में, हम दिखाते हैं कि उपकरण का उपयोग अन्य प्रजातियों जैसे कि जापानी चावल मछली मेडका में भ्रूण संबंधी जोड़तोड़ के लिए भी किया जा सकता है।
Mangold और Spemann के शास्त्रीय प्रयोगों से, जो एक भ्रूण अक्ष 1 के गठन का निर्देश देने वाले एक आयोजक के अस्तित्व का प्रदर्शन करते हैं, भ्रूण के बीच कोशिकाओं का प्रत्यारोपण भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक स्थापित तकनीक बन गया है2,3,4,5,6,7,8,9,10 . प्रत्यारोपण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले सेटअप में एक माइक्रोमीटर ड्राइव-नियंत्रित गैस-तंग सिरिंज होती है जो लचीली टयूबिंग के माध्यम से एक माइक्रोपिपेट धारक से जुड़ी होती है और खनिज तेल 12,13 से भरा एक जलाशय होता है। इस सेटअप में, सिरिंज के प्लंजर को एक पेंच के माध्यम से ले जाया जाता है। इस तरीके से उत्पन्न दबाव को माइक्रोपिपेट में स्थानांतरित कर दिया जाता है और एक भ्रूण से कोशिकाओं को बाहर निकालने और उन्हें दूसरे में जमा करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इस हाइड्रोलिक रूप से संचालित डिवाइस में कई भाग होते हैं और खरोंच से इकट्ठा करने के लिए श्रमसाध्य है। इसी तरह के उपकरणों को एक पूर्ण कार्य सेट के रूप में भी खरीदा जा सकता है, आमतौर पर मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर्स के रूप में बेचा जाता है, और इन वाणिज्यिक संस्करणों की लागत आमतौर पर 1500 यूएस $ से अधिक होती है। घर के बने और वाणिज्यिक संस्करण दोनों में, भ्रूण हेरफेर के लिए माइक्रोपिपेट को तेल से भरे टयूबिंग के माध्यम से दबाव पैदा करने वाले डिवाइस (गैस-तंग सिरिंज) से अलग किया जाता है। माइक्रोपिपेट के हेरफेर और प्लंजर के आंदोलन, इसलिए, अलग-अलग हाथों से अलग-अलग संचालित किया जाना चाहिए, जिससे थ्रूपुट और उपयोगिता कम हो जाती है। इसके अलावा, उपकरणप्रतिरोपण के लिए तैयार करने के लिए बोझिल हैं क्योंकि ट्यूबिंग को बुलबुले के गठन से बचने के दौरान तेल से सावधानीपूर्वक भरने की आवश्यकता होती है। यहां, हम सेल हटाने और प्रत्यारोपण के लिए एक वैकल्पिक वायवीय रूप से संचालित डिवाइस का वर्णन करते हैं जो सस्ती, इकट्ठा करने में आसान और उपयोग करने में आसान है।
यहां प्रस्तुत डिवाइस में एक माइक्रोपिपेट धारक के साथ फिट 25 μL गैस-तंग सिरिंज शामिल है और इसकी लागत कुल मिलाकर 80 अमेरिकी डॉलर से कम है। डिवाइस आसानी से Luer ताला फिटिंग (चित्रा 1A) के माध्यम से सिरिंज में माइक्रोपिपेट धारक डालने के द्वारा इकट्ठा किया जाता है। डिवाइस को तब सीधे एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर लगाया जाता है, जिससे उपयोगकर्ता को अपनी स्थिति और सक्शन दोनों को सीधे माइक्रोमैनिपुलेटर पर एक ही हाथ से नियंत्रित करने की अनुमति मिलती है। यह आसानी से दूसरे हाथ को स्थिर करने और दाता और मेजबान भ्रूण युक्त प्रत्यारोपण पकवान को स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र छोड़ देता है। डिवाइस हवा के साथ प्रत्यक्ष सक्शन द्वारा काम करता है और खनिज तेल से भरने की आवश्यकता नहीं है। पानी और कांच की सुई की दीवारों के बीच आकर्षक बलों के कारण, सिरिंज के प्लंजर में एक बड़े आंदोलन को सुई के भीतर पानी के स्तर में एक छोटे से आंदोलन में अनुवादित किया जाता है, जब तक कि पानी का स्तर कांच की सुई के पतले अंत में होता है। यह एस्पिरेटेड कोशिकाओं की संख्या और उनके सम्मिलन के स्थान पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है।
इस डिवाइस की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम ज़ेबराफ़िश (डैनियो रीरियो) भ्रूण में तीन अनुप्रयोगों को प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि स्रावित सिग्नलिंग अणुओं के स्थानीयकृत स्रोतों को कैसे उत्पन्न किया जाए, जिसका उपयोग ग्रेडिएंट गठन 2,4,6 का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, दाता भ्रूण को एमआरएनए एन्कोडिंग के साथ इंजेक्ट किया जाता है जो फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सिग्नलिंग अणु को एन्कोडिंग करता है। प्रतिदीप्ति-लेबल वाले दाता कोशिकाओं को तब जंगली-प्रकार के मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जाता है जहां सिग्नल ग्रेडिएंट के गठन को चित्रित और विश्लेषण किया जा सकता है। दूसरा, हम वर्णन करते हैं कि डिवाइस का उपयोग आकार-कम भ्रूण 5,13 उत्पन्न करने के लिए एक्सटिर्पेशन द्वारा कोशिकाओं को हटाने के लिए कैसे किया जा सकता है। अंत में, हम दिखाते हैं कि मेजबान भ्रूण में एक आदिम रोगाणु सेल रिपोर्टर ले जाने वाली कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके मातृ-युग्मनज उत्परिवर्ती का मजबूत उत्पादन कैसे किया जाए, जिसमें रोगाणु रेखा को 6,10 से अधिक किया गया था। भविष्य में, यहां वर्णित प्रत्यारोपण उपकरण को आसानी से अन्य भ्रूणीय जोड़तोड़ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसके लिए कोशिकाओं को हटाने या प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है।
एक प्रत्यारोपण प्रयोग की सफलता दृढ़ता से प्रयोगकर्ता के ठीक मोटर कौशल पर निर्भर करती है। प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, अभ्यास की आवश्यकता होती है। हालांकि, यहां प्रस्तुत उपकरण बाजार पर दूसरों की तुलना में सीखने और उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और, सामान्य तौर पर, केवल कुछ दिनों के अभ्यास की आवश्यकता होती है।
प्रत्यारोपण प्रक्रिया की सफलता को कई सावधानियां बरतकर बढ़ाया जा सकता है। एक कदम यह सुनिश्चित करना है कि माइक्रोमैनिपुलेटर अच्छी गुणवत्ता का है और चिकनी संचालन में सक्षम है। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में उच्च आवर्धन के साथ एक ओकुलर जोड़ने से भ्रूण के सापेक्ष सुई को ठीक से स्थिति में रखने में मदद मिल सकती है। स्वस्थ भ्रूण प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से प्रजनन जेब्राफ़िश या मेडका का उपयोग करना और हैंडलिंग के दौरान भ्रूण को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखना (विशेष रूप से डिकोरियनेशन चरण के दौरान और बाद में) भी सफलता दर को बढ़ाएगा।
विलंबित विषाक्तता के साथ समस्याओं का निवारण करना अधिक कठिन हो सकता है। यदि कुछ घंटों के बाद एक भ्रूण मर जाता है – लेकिन प्रत्यारोपण के तुरंत बाद नहीं – जर्दी को सुई द्वारा क्षतिग्रस्त कर दिया गया हो सकता है (उदाहरण के लिए, भ्रूण में बहुत गहराई से प्रवेश करके), या शायद कोशिकाओं को बहुत बलपूर्वक बाहर निकाल दिया गया था। विलंबित विषाक्तता और भ्रूण की मृत्यु भी दाता कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट की गई जर्दी या सेल मलबे के परिणामस्वरूप हो सकती है; एक और कारण रिंगर के समाधान में HEPES बफर बिगड़ सकता है। इन समस्याओं को कोशिकाओं को धोकर दूर किया जा सकता है (चरण 1.3.8 देखें) या बस क्रमशः बफर के एक नए बैच का उपयोग करके। इसके अलावा, जर्मलाइन प्रत्यारोपण प्रयोगों में विकृत मेजबान भ्रूण अत्यधिक उच्च मॉर्फोलिनो सांद्रता के परिणामस्वरूप हो सकता है। मेजबान के जंगली-प्रकार के जर्मलाइन को पूरी तरह से कम करने के लिए पर्याप्त मॉर्फोलिनो का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जिससे इन कोशिकाओं को संतानों में योगदान करने से रोका जा सकता है – लेकिन एक ही समय में, अत्यधिक उच्च मॉर्फोलिनो सांद्रता से बचने की आवश्यकता है। सभी इंजेक्ट किए गए मेजबान भ्रूण (एक विशिष्ट प्रयोग में कुछ सौ) में लगातार मॉर्फोलिनो मात्रा इसलिए जर्मलाइन प्रत्यारोपण की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यह एक आसानी से दिखाई देने वाले अनुरेखक डाई 14 के साथ मॉर्फोलिनो इंजेक्शन मिश्रण को पूरक करके मदद की जा सकती है, जिसे यह सुनिश्चित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत ट्रैक किया जा सकता है कि सभी भ्रूण एक ही इंजेक्शन की मात्रा प्राप्त करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं में विशेष रूप से ब्लास्टुला-स्टेज ज़ेब्राफ़िश या मेडका भ्रूण में कोशिकाओं के जोड़तोड़ शामिल हैं, लेकिन भविष्य में, प्रत्यारोपण सुई के व्यास और आकार को बदलकर डिवाइस को विभिन्न चरणों और प्रजातियों के अनुकूल बनाना संभव होगा।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौते संख्या 637840 (क्वांटपैटर्न) और अनुदान समझौते नंबर 863952 (एसीई-ओएफ-स्पेस)) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ था।
1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
Agarose | To coat plastic dishes | ||
Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
Stereomicroscope | For injection and transplantation |