מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה
Summary
מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.
Abstract
מניפולציות עובריות קלאסיות, כגון הסרת תאים והשתלת תאים בתוך העוברים או בין, הן טכניקות רבות עוצמה לחקר תהליכים התפתחותיים מורכבים. עוברים דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי למניפולציות אלה מכיוון שהם נגישים בקלות, גדולים יחסית בגודלם ושקופים. עם זאת, מכשירים שפותחו בעבר להסרת תאים והשתלה מסורבלים לשימוש או יקרים לרכישה. לעומת זאת, מכשיר ההשתלה המוצג כאן הוא חסכוני, קל להרכבה ופשוט לשימוש. בפרוטוקול זה, אנו מציגים לראשונה את הטיפול במכשיר ההשתלה, כמו גם את הרכבו מחלקים זמינים מסחרית ונרחבת. לאחר מכן אנו מציגים שלושה יישומים לשימוש בו: יצירת שיבוטים חוץ רחמיים לחקר פיזור אותות ממקורות מקומיים, פירוק תאים לייצור עוברים מופחתי גודל, והשתלת נבטים כדי ליצור מוטציות אימהיות-זיגוטיות. לבסוף, אנו מראים כי הכלי יכול לשמש גם עבור מניפולציות עובריות במינים אחרים כגון medaka דג אורז יפני.
Introduction
מהניסויים הקלאסיים של מנגולד ושפמן שהדגימו את קיומו של מארגן המורה על היווצרות ציר עוברי1, השתלת תאים בין עוברים הפכה לטכניקה מבוססת לחקר התפתחות עוברית2,3,4,5,6,7,8,9,10 . התקנה נפוצה להשתלה מורכבת ממזרק גז הדוק בכונן מיקרומטר המחובר למחזיק מיקרופיפט באמצעות צינורות גמישים ומאגר מלא בשמן מינרלי12,13. במערך זה, הבוכנה של המזרק מועברת דרך בורג. הלחץ שנוצר באופן זה מועבר למיקרופיט ומשמש לשאוב תאים מעובר אחד ולהפקיד אותם בעובר אחר. עם זאת, מכשיר זה המופעל הידראולי מורכב מחלקים רבים והוא מייגע להרכיב מאפס. מכשירים דומים ניתן לרכוש גם כסט עבודה מלא, נמכר בדרך כלל כמו Microinjectors ידני, וגרסאות מסחריות אלה בדרך כלל עולה יותר מ 1500 US$. הן בגרסה הביתית והן בגרסה המסחרית, המיקרופיט למניפולציה עוברית מופרד מהמכשיר לייצור לחץ (המזרק ההדוק בגז) באמצעות צינורות מלאים בנפט. המניפולציה של micropipette ואת התנועה של הבוכנה, ולכן, צריך להיות מופעל בנפרד עם ידיים שונות, הפחתת התפוקה ואת השירות. יתר על כן, המכשירים מסורבלים כדי להתכונן להשתלה מאז הצינורות צריך להיות מלא בזהירות עם שמן תוך הימנעות היווצרות של בועות. כאן, אנו מתארים מכשיר חלופי המופעל פנאומטית להסרת תאים והשתלה שהוא זול, קל להרכבה ופשוט לשימוש.
המכשיר המוצג כאן כולל מזרק 25 μL גז הדוק מצויד מחזיק micropipette ועולה פחות מ 80 $ בסך הכל. המכשיר מורכב בקלות על-ידי החדרת מחזיק המיקרופייט למזרק באמצעות התאמת מנעול לוהר (איור 1A). לאחר מכן המכשיר מותקן ישירות על מיקרו-מניפולטור, ומאפשר למשתמש לשלוט הן במיקום שלו והן בשאיבה ביד אחת ישירות במיקרו-מניפולטור. זה משאיר בנוחות את היד השנייה חופשית לייצב ולהזיז את צלחת ההשתלה המכילה עוברים תורם ומארח. המכשיר עובד על ידי יניקה ישירה עם אוויר ולא צריך להיות מלא בשמן מינרלי. בשל הכוחות האטרקטיביים בין המים לקירות מחט הזכוכית, תנועה גדולה בבוכנה של המזרק מתורגמת לתנועה קטנה יותר במפלס המים בתוך המחט, כל עוד מפלס המים נמצא בקצה המחודד של מחט הזכוכית. זה מאפשר שליטה מדויקת על מספר התאים השאפתניים ועל מיקום הכניסה שלהם.
כדי להדגים את התועלת של מכשיר זה, אנו מציגים שלושה יישומים בעוברי דגי זברה (דניו ריו). ראשית, אנו מראים כיצד ליצור מקורות מקומיים של מולקולות איתות מופרשות, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור היווצרות הדרגתית2,4,6. כאן, עוברים תורמים מוזרקים עם קידוד mRNA מולקולת איתות פלואורסצנטית. התאים התורמים המסומנים בפלואורסצנטיות מושתלים לאחר מכן בעוברים מארחים מסוג בר, שם ניתן לדמיין ולנתח את היווצרותו של שיפוע אות. שנית, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במכשיר כדי להסיר תאים על ידי extirpation על מנת ליצור עוברים מופחת גודל5,13. לבסוף, אנו מראים כיצד לייצר מוטציות אימהיות-זיגוטיות על ידי השתלת תאים הנושאים כתב תא נבט קדמוני לעוברים מארחים שבהם קו הנבט היה אבלה 6,10. בעתיד, מכשיר ההשתלה המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות למניפולציות עובריות אחרות הדורשות הסרה או השתלה של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההצלחה של ניסוי השתלה מסתמכת מאוד על הכישורים המוטוריים העדינים של הנסיין. כדי לבצע בהצלחה את ההליכים, יש צורך בתרגול. עם זאת, המכשיר המוצג כאן קל יחסית ללמוד ולהשתמש בהשוואה לאחרים בשוק, ובכלל, רק כמה ימים של תרגול נדרשים.
ההצלחה של הליך ההשתלה ניתן לשפר על ידי נקיטת מספר אמצעי זהירות. צעד אחד הוא להבטיח כי micromanipulator הוא באיכות טובה ומסוגל לפעולה חלקה. הוספת עינית עם הגדלה גבוהה יותר לסטריאומיקוסקופ יכולה לעזור למקם במדויק את המחט ביחס לעובר. שימוש בדגי זברה או מדאקה רבייה היטב כדי לרכוש עוברים בריאים ודואג לא לפגוע בעוברים במהלך הטיפול (במיוחד במהלך שלב ההפחתה ואחריו) ישפר גם את שיעור ההצלחה.
בעיות עם רעילות מושהית יכול להיות קשה יותר לפתור. אם עובר מת לאחר כמה שעות – אך לא מיד לאחר ההשתלה – ייתכן שהחלמון נפגע מהמחט (למשל, על ידי כניסה עמוקה מדי לעובר), או אולי התאים נפלטו בכוח רב מדי. רעילות מאוחרת ומוות עוברי יכולים לנבוע גם חלמון או פסולת תאים מוזרקים יחד עם התאים התורמים; סיבה נוספת יכולה להיות חיץ HEPES מתדרדר בפתרון של הצלצול. ניתן להתגבר על בעיות אלה על ידי שטיפת התאים (ראה שלב 1.3.8) או פשוט על ידי שימוש באצווה חדשה של חוצץ, בהתאמה. יתר על כן, עוברים מארח מעוות בניסויים השתלת נבטים עלול לנבוע ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי. זה חיוני להשתמש מספיק מורפולינו כדי לפטור לחלוטין את הנבט מסוג הפרא של המארח, ובכך למנוע תאים אלה לתרום לצאצאים – אבל באותו זמן, ריכוזי מורפולינו גבוהים מדי יש להימנע. כמויות מורפולינו עקביות בכל העוברים המארחים המוזרקים (כמה מאות בניסוי טיפוסי) הן אפוא המפתח להצלחת השתלות נבטים. זה יכול להיות עזר על ידי שכשהם את תערובת הזרקת מורפולינו עם צבע מעקב גלוי בקלות14, אשר ניתן לעקוב תחת סטריאופיקוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח כי כל העוברים מקבלים את אותו נפח הזרקה.
ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה כוללים באופן בלעדי מניפולציות של תאים בדגי זברה בשלב blastula או בעוברי מדאקה, אך בעתיד, סביר להניח שניתן יהיה להתאים את המכשיר לשלבים ומינים שונים על ידי שינוי הקוטר והצורה של מחט ההשתלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי חברת מקס פלאנק וקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס’ 637840 (QUANTPATTERN) והסכם מענק מס ‘ 863952 (ACE-OF-SPACE)).
Materials
| 1.0 mm glass capillary, ends cut without filament | To make the transplantation needle | ||
| 200 mL glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| 24-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 6-well plastic plate | To be coated with agarose in order to incubate embryos | ||
| Agarose | To coat plastic dishes | ||
| Dnd1 morpholino | Gene Tools | Sequence: GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT |
|
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Fluorescence stereomicroscope with GFP/RFP filters and light source | To assess YSL injections and germ-line transplantations | ||
| Glass micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | To make the transplantation needle |
| Glass pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For pipetting embryos; the tips can be flamed to smoothen out the edge |
| Incubator at 28 °C | For incubating zebrafish embryos | ||
| Luer tip 25 μL Hamilton syringe, 1700 series | Hamilton | Ref: 80201 | Part of the transplantation device |
| Manual micromanipulator with 3 axes of movement | Narishige | M-152 | For controlling the transplantation device |
| Manual pipetting pump | Bio-Tek | Cat. # 641 | For use with the glass pipettes to transfer embryos |
| Metal dissecting probe | For moving and rotating zebrafish embryos | ||
| Microforge | Narishige | MF2 | To make the transplantation needle |
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and morpholino into embryos | ||
| Microinjection molds, triangular grooves | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare microinjection plates with agarose |
| Microinjection-molds, single wells | Adaptive Science Tools | PT-1 | To prepare transplantation plates with agarose |
| Micropipette holder with Luer fitting for a 1.0 mm glass capillary | World Precision Instruments | MPH6S10 | Part of the transplantation device |
| mMessage mMachine Sp6 transcription kit |
Life Technologies | AM1340M | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Plasmid with GFP-nos1 3'UTR | Plasmid that can be transcriped to produce mRNA encoding GFP with the 3'UTR of nos1 | ||
| Plastic petri dish 100 mm | To be coated with agarose in order to make injection and transplantation dishes | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | For embryo dechorionation: Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos |
| Ringer’s solution | For 1 L: Add 6.78 g of NaCl, 0.22 g of KCl, 0.26 g of CaCl2 and 1.19 g of HEPES; then fill to 1 L; adjust pH to 7.2; sterilize by filtration | ||
| Stereomicroscope | For injection and transplantation |
References
- Spemann, H., Mangold, H. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. Archives for Microscopic Anatomy and Developmental Mechanics. 100 (3-4), 599-638 (1924).
- Müller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
- Donovan, P., et al. Paracrine Activin-A signaling promotes melanoma growth and metastasis through immune evasion. Journal of Investigative Dermatology. 137 (12), 2578-2587 (2017).
- Pomreinke, A. P., et al. Dynamics of BMP signaling and distribution during zebrafish dorsal-ventral patterning. eLife. 6, 25861 (2017).
- Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signaling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
- Soh, G. H., Pomreinke, A. P., Müller, P. Integration of Nodal and BMP signaling by mutual signaling effector antagonism. Cell Reports. 31 (1), 107487 (2020).
- Mahalwar, P., Walderich, B., Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Local reorganization of xanthophores fine-tunes and colors the striped pattern of zebrafish. Science. 345 (6202), 1362-1364 (2014).
- Frohnhöfer, H. G., Krauss, J., Maischein, H. M., Nüsslein-Volhard, C. Iridophores and their interactions with other chromatophores are required for stripe formation in zebrafish. Development. 140 (14), 2997-3007 (2013).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germline replacement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14919-14924 (2002).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edn. , (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (29), e1394 (2009).
- Capek, D., Müller, P. Positional information and tissue scaling during development and regeneration. Development. 146 (24), 177709 (2019).
- Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52266 (2015).
- Carvalho, L., Heisenberg, C. P. The yolk syncytial layer in early zebrafish development. Trends in Cell Biology. 20 (10), 586-592 (2010).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2055 (2010).
- Centanin, L., Hoeckendorf, B., Wittbrodt, J. Fate restriction and multipotency in retinal stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 553-562 (2011).
