Descriviamo strumenti ottimizzati per studiare il cuore di zebrafish in vivo con microscopia a fluorescenza a foglio leggero. In particolare, suggeriamo linee transgeniche cardiache luminose e presentiamo nuove delicate tecniche di incorporamento e immobilizzazione che evitano difetti dello sviluppo e cardiaci. Viene inoltre fornita una possibile pipeline di acquisizione e analisi dei dati adattata all’imaging cardiaco.
La ricerca cardiaca embrionale ha tratto grandi benefici dai progressi nella microscopia a fluorescenza veloce in vivo a foglio di luce (LSFM). In combinazione con il rapido sviluppo esterno, la genetica trattabile e la traslucenza del pesce zebra, Danio rerio, LSFM ha fornito approfondimenti sulla forma e la funzione cardiaca ad alta risoluzione spaziale e temporale senza fototossicità o fotosbiancamento significativi. L’imaging di cuori pulsanti sfida le tecniche esistenti di preparazione dei campioni e microscopia. È necessario mantenere un campione sano in un campo visivo ristretto e acquisire immagini ultraveloci per risolvere il battito cardiaco. Qui descriviamo strumenti e soluzioni ottimizzati per studiare il cuore di zebrafish in vivo. Dimostriamo le applicazioni di linee transgeniche luminose per l’etichettatura dei costituenti cardiaci e presentiamo nuove tecniche di incorporamento e immobilizzazione delicate che evitano difetti dello sviluppo e cambiamenti nella frequenza cardiaca. Proponiamo anche una pipeline di acquisizione e analisi dei dati adattata all’imaging cardiaco. L’intero flusso di lavoro qui presentato si concentra sull’imaging cardiaco embrionale del pesce zebra, ma può anche essere applicato a vari altri campioni ed esperimenti.
Per scoprire gli eventi complessi e le interazioni nel cuore che batte precocemente, è necessaria l’imaging in vivo dell’intero organo. Con la sua fototossicità minima1,2,3, il basso fotosbiancamento4 e l’alta velocità, la microscopia a foglio luminoso si è evoluta come strumento di imaging primario per lo sviluppo embrionale e cardiaco5,6. Ha fornito approfondimenti sulla forma e la funzione cardiaca ad alta risoluzione spaziale e temporale7,8,9 e ha permesso ai ricercatori di visualizzare e tracciare parti del cuore etichettate fluorescentmente ad alta velocità, studiare le forze emodinamiche e seguire lo sviluppo del cuore direttamente all’interno del corpo degli embrioni in via di sviluppo6,10,11,12.
Per vincolare in modo preciso e riproducibile il pesce zebra nel campo visivo, esiste una varietà di protocolli di incorporamento per fogli luminosi, a breve e lungo termine, nonché campioni singoli o multipli13,14,15,16,17,18,19. Il protocollo più comune prevede l’immobilizzazione della tricaina e il montaggio dell’agarosio all’interno di un tubo di vetro o di plastica. Tuttavia, poiché la frequenza cardiaca può cambiare a causa della temperatura, degli anestetici e del materiale di incorporamento utilizzato20,21,22, l’imaging cardiaco del pesce zebra richiede protocolli specifici e delicati per garantire la salute del campione6,8,11,12,20,21,22,23 . Per l’imaging a breve termine (fino a un’ora), è possibile anestetizzare il pesce in tricaina da 130 mg / L e incorporarlo in tubi di etilene propilene fluorurato (FEP) con soluzione di agarosio allo 0,1% e una spina, come descritto in Weber et al. 201416. Tuttavia, poiché la tricaina può portare a difetti dello sviluppo20,22, è necessario utilizzare protocolli diversi per l’imaging a lungo termine.
Qui descriviamo una nuova strategia per l’imaging cardiaco a lungo termine. Sebbene esistano molte implementazioni di fogli luminosi24, si consiglia di utilizzare un campione sospeso in un microscopio T-SPIM (una lente di rilevamento e due lenti di illuminazione su un piano orizzontale con il campione appeso verticalmente nella messa a fuoco comune). Ciò offre la necessaria libertà di movimento e rotazione per il posizionamento preciso del campione. I pesci vengono immobilizzati iniettando 30 pg α-bungarotossina mRNA allo stadio a una o due cellule. α-bungarotossina è un veleno di serpente che paralizza i muscoli senza influenzare lo sviluppo cardiovascolare o la fisiologia22. Per un’imaging preciso e privo di distorsioni, si consiglia di montare i pesci in tubi fatti di FEP, un polimero con un indice di rifrazione quasi identico all’acqua. Discutiamo di come preparare al meglio i tubi FEP raddrizzandoli e pulendoli prima dell’imaging. I pesci vengono quindi montati in questi tubi, a testa in giù, nei media, e il fondo del tubo è sigillato con un tappo di agarosio al 2%, su cui poggiano le teste dei pesci. I fori di taglio nel tubo FEP facilitano lo scambio di gas e garantiscono la crescita dei pesci. Il pesce incorporato può essere conservato nei supporti fino a quando non viene montato su un portacampioni subito prima dell’imaging. Suggeriamo anche una pipeline di acquisizione e analisi dei dati per immagini riproducibili ad alta velocità. Inoltre, discutiamo l’uso di linee transgeniche citoplasmatiche rispetto a quelle marcatori di membrana per una robusta etichettatura delle cellule cardiache, nonché diverse opzioni per fermare il cuore. Queste tecniche di montaggio garantiscono la salute del campione consentendo al contempo di vincolare il cuore in modo preciso e riproducibile nel campo visivo.
Linee transgeniche per immaginare il cuore
Figura 6: Confronto delle linee transgeniche di zebrafish citoplasmatiche e marcatori di membrana. Vista anteriore-ventrale di cuori di zebrafish da 48 hpf ripresi con LSFM. Le frecce bianche indicano strutture visibili solo con una linea transgenica marcatore di membrana. a) Segnale Tg(kdrl:EGFP)32 in ciano nel cuore e (a’) nel ventricolo. b) Segnale Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; segnale myl7:dsRed)33 in rosso nel cuore e (b’) nel ventricolo. ( c,c’) fusione del segnale Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) e Tg(kdrl:EGFP). Scala a barre 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L’imaging del cuore del pesce zebra richiede un’etichettatura precisa delle cellule cardiache. Mentre lo spessore miocardico è relativamente costante in tutte le cellule, le cellule endocardiche sono spesse intorno al nucleo ma hanno sottili sporgenze di membrana, in alcune regioni più sottili di 2 μm. Le linee transgeniche citoplasmatiche come Tg(kdrl:EGFP)32 etichettano efficacemente le regioni intorno ai nuclei endocardici, ma più lontano, il citoplasma sottile potrebbe non emettere abbastanza fotoni da essere rilevato con tempi di esposizione così brevi, portando a buchi artificiali nei dati (Figura 6a). Al contrario, le linee transgeniche dei marcatori di membrana come Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 possono etichettare efficacemente l’endocardio e rivelare maggiori dettagli (Figura 6b,c). Per ogni esperimento, scegli con cura la linea transgenica più appropriata.
Immobilizzazione del pesce zebra
La scelta della tecnica di immobilizzazione dipende dalla durata dell’esperimento e dall’età del pesce da immaginare. La tricaina è stata comunemente usata per l’immobilizzazione del pesce zebra, principalmente grazie alla sua facilità d’uso. Infatti, la semplice aggiunta di 130 mg / L di tricaina ai mezzi di pesce si traduce nella loro anestesia in 10 minuti. Poiché può portare a difetti dello sviluppo e influenzare la fisiologia del cuore20,22, si consiglia di utilizzare la tricaina solo per brevi esperimenti (meno di 30 min). Per l’imaging più lungo, le iniezioni di mRNA α-bungarotossina allo stadio a una o due cellule paralizzano i pesci fino a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) senza influire sullo sviluppo cardiovascolare o sulla fisiologia22.
Scegliere i tubi FEP giusti
I tubi FEP sono disponibili in vari diametri e spessori. Per l’immagine di pesci 0-5 dpf, 0,8 mm è un buon diametro interno; scegli tubi a parete spessa 0,8 x 1,6 mm o tubi a parete sottile 0,8 x 1,2 mm. Raccomandiamo tubi a parete sottile; tuttavia, le pareti più spesse offrono maggiore stabilità e rigidità, che possono essere importanti se la camera del campione ha fluidi fluenti che potrebbero interrompere e spostare un tubo sottile. Per campioni più grandi, è possibile utilizzare 1,6 x 2,4 mm e 2 x 3 mm.
Scambi di temperatura e gas
Un aspetto essenziale del benessere dell’embrione di zebrafish è la temperatura. Idealmente, mantenere il pesce a 28,5 °C durante l’imaging, poiché la temperatura dell’ambiente influisce sullo sviluppo e sulla frequenza cardiaca34.
Nella nostra esperienza, lo scambio di ossigeno attraverso il tappo di agarosio al 2% mantiene solo una frequenza cardiaca stabile fino a 3-4 dpf. Pertanto, i fori di taglio nel tubo garantiscono la diffusione dell’ossigeno. Può anche essere necessario per la consegna del farmaco al campione, se lo si desidera.
Sospensione del battito cardiaco.
Le elevate velocità di acquisizione dei microscopi a foglio luminoso opportunamente equipaggiati consentono la registrazione del cuore pulsante in vivo. Tuttavia, per acquisire uno z-stack indisturbato, si può rallentare o fermare il cuore. Tuttavia, fermare il cuore porta al rilassamento del muscolo cardiaco e potrebbe causare il collasso del cuore6. La sospensione del battito cardiaco può essere eseguita utilizzando morfolinos, basse temperature, un inibitore della contrazione muscolare o optogenetica. Questi metodi hanno ciascuno i loro svantaggi e devono essere attentamente valutati per ogni esperimento.
L’iniezione di 4 ng di morfolino cardiaco silenzioso (sih) allo stadio di una cellula può fermare il battito cardiaco prendendo di mira il gene tnnt2a cruciale per la formazione del sarcomero35. Sih zebrafish non hanno un battito cardiaco e sopravvivono solo fino a 7 dpf, quando gli embrioni iniziano a fare affidamento sul sangue circolante per l’ossigenazione. Poiché la morfogenesi cardiaca è guidata da forze sia genetiche che biomeccaniche36, questi pesci presentano malformazioni cardiache intorno a 3 dpf.
Poiché il flusso di Ca2+ è sensibile alla temperatura, la temperatura influenza la frequenza cardiaca nel pesce zebra embrionale21. Di conseguenza, l’abbassamento della temperatura nella camera di imaging rallenta il battito cardiaco. Fermare il battito cardiaco richiede temperature inferiori a 15 °C. Poiché i pesci zebra sono solitamente mantenuti a 28,5 ° C, tali basse temperature possono essere mantenute solo per brevi periodi (meno di 10 minuti).
Farmaci come gli inibitori chimici delle contrazioni muscolari, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), possono essere aggiunti al mezzo zebrafish (50 nM37,38) per sospendere temporaneamente il battito cardiaco. BDM è comodo da usare in quanto ferma la contrazione cardiaca in meno di 15 minuti e può essere lavato via per ripristinare la funzione cardiaca. Tuttavia, poiché il BDM altera il potenziale d’azione cardiaco, deve essere usato con cautela37.
Infine, il cuore del pesce zebra transgenico che esprime canali ionici leggeri o pompe come channelrhodopsin o halorhodopsin nel loro miocardio può essere manipolato e fermato illuminando il pacemaker nel tratto di afflusso con luce39,7,40,41,9.
Prospettiva
Gli strumenti e le soluzioni ottimizzati presentati per studiare il cuore del pesce zebra in vivo consentono un’imaging delicato a lungo termine delle dinamiche cardiache ultraveloci. L’incorporamento del campione può essere adattato per adattarsi a diverse modalità di imaging, come la microscopia confocale, la microscopia a due fotoni o la tomografia a proiezione ottica (OPT). La microscopia a foglio luminoso, tuttavia, è probabilmente la tecnica preferita che offre il sezionamento ottico a una velocità sufficiente per catturare la dinamica del cuore. Mentre questo protocollo si concentra sull’imaging cardiaco embrionale del pesce zebra, riteniamo che potrebbe essere applicato anche a vari altri campioni ed esperimenti. Sarà interessante vedere in futuro se tecniche di incorporamento e imaging simili possono essere utilizzate anche in fasi successive durante lo sviluppo, quando il cuore è più nascosto e la larva meno traslucida.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Madelyn Neufeld per l’illustrazione in Figura 2h. Questo lavoro è stato supportato dalla Max Planck Society, dal Morgridge Institute for Research, dalla Chan Zuckerberg Initiative e dallo Human Frontier Science Program (HFSP).
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |