我们描述了用光片荧光显微镜 在体内 研究斑马鱼心脏的优化工具。具体而言,我们建议使用明亮的心脏转基因系,并提出新的温和嵌入和固定技术,以避免发育和心脏缺陷。还提供了适用于心脏成像的可能的数据采集和分析管道。
胚胎心脏研究极大地受益于快速 体内 光片荧光显微镜(LSFM)的进步。结合斑马鱼的快速外部发育,可处理的遗传学和半透明性, Danio rerio,LSFM以高空间和时间分辨率提供了对心脏形态和功能的见解,没有显着的光毒性或光漂白。心脏跳动的成像对现有的样品制备和显微镜技术提出了挑战。需要在狭窄的视野中保持健康的样本,并获得超快的图像以解析心跳。在这里,我们描述了在体内研究斑马鱼心脏的优化工具和 解决方案。我们展示了明亮的转基因系在标记心脏成分方面的应用,并提出了新颖的温和嵌入和固定技术,以避免发育缺陷和心率变化。我们还提出了一种适用于心脏成像的数据采集和分析管道。这里介绍的整个工作流程侧重于斑马鱼胚胎心脏成像,但也可以应用于各种其他样品和实验。
为了揭示早期跳动心脏中的复杂事件和相互作用,需要对整个器官进行体内成像。凭借其最小的光毒性1,2,3,低光漂白4和高速,光片显微镜已发展成为胚胎和心脏发育的主要成像工具5,6。它以高空间和时间分辨率7,8,9提供了对心脏形态和功能的见解,并使研究人员能够以高速成像和跟踪荧光标记的心脏部位,研究血动力,并直接跟踪发育中的胚胎体内的心脏发育6,10,11,12。
为了精确和可重复地限制斑马鱼在视野中,存在各种用于光片的嵌入方案,短期和长期,以及单样本或多样本13,14,15,16,17,18,19。最常见的方案涉及三卡因固定和琼脂糖安装在玻璃或塑料管内。然而,由于温度、麻醉剂和所使用的包埋材料,心率可能会发生变化20、21、22,斑马鱼心脏成像需要具体、温和的实验方案来确保样品健康6,8、11、12、20、21、22、23.对于短期成像(长达一小时),可以将鱼麻醉在130 mg / L三卡因中,并将其嵌入含0.1%琼脂糖溶液和塞子的氟化乙烯丙烯(FEP)管中,如Weber等人201416所述。然而,由于三卡因可导致发育缺陷20,22,因此必须使用不同的方案进行长期成像。
在这里,我们描述了一种长期心脏成像的新策略。虽然存在许多光片实现24,但我们建议在T-SPIM显微镜中使用悬挂样品(一个检测和两个照明透镜在水平面上,样品垂直悬挂在公共焦点中)。这为精确的样品定位提供了必要的移动和旋转自由度。通过在单细胞或双细胞阶段注射30pg α-bungarotoxin mRNA来固定鱼。α-bungarotoxin是一种蛇毒,可麻痹肌肉而不影响心血管发育或生理学22。为了获得精确、无失真的成像,我们建议将鱼镶嵌在由FEP制成的管子中,FEP是一种折射率几乎与水相同的聚合物。我们讨论了如何在成像之前通过拉直和清洁FEP管来最好地准备FEP管。然后将鱼头朝下安装在这些管子中,放在介质中,并用2%琼脂糖塞密封管的底部,鱼头放在该塞子上。在FEP管上切割孔有助于气体交换并确保鱼的生长。嵌入的鱼可以保存在培养基中,直到在成像前安装到样品架上。我们还建议使用数据采集和分析管道,以实现可重复的高速成像。此外,我们讨论了使用细胞质与膜标记转基因系进行稳健的心脏细胞标记,以及停止心脏的不同选择。这些安装技术可确保样品的健康,同时允许在视野中精确且可重复地约束心脏。
用于对心脏成像的转基因细胞系
图6:细胞质和膜标记斑马鱼转基因品系的比较。 用LSFM成像的48 hpf斑马鱼心脏的前腹视图。白色箭头表示仅通过膜标记转基因线可见的结构。(a) Tg(kdrl:EGFP)32 信号在心脏呈青色,(a’) 在心室中。(b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 信号在心脏呈红色,(b’) 在心室中。( c,c’) 合并 Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) 和 Tg(kdrl:EGFP) 信号。比例尺 50 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
对斑马鱼心脏进行成像需要精确的心脏细胞标记。虽然整个细胞的心肌厚度相对恒定,但心内膜细胞在细胞核周围较厚,但具有薄膜突起,在某些区域薄于2μm。细胞质转基因系如Tg(kdrl:EGFP)32 有效地标记了心内膜核周围的区域,但更远的地方,薄细胞质可能无法发出足够的光子,无法在如此短的曝光时间内检测到,从而导致数据中的人造孔(图6a)。相比之下,膜标记转基因系如Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 可以有效地标记心内膜并揭示更多细节(图6b,c)。对于每个实验,仔细选择最合适的转基因品系。
斑马鱼固定
固定技术的选择取决于实验的长度和鱼的成像年龄。三卡因通常用于斑马鱼固定,主要是因为它的易用性。事实上,只需向鱼培养基中添加130 mg / L三卡因即可在10分钟内麻醉。由于它可能导致发育缺陷并影响心脏生理学20,22,我们建议仅在短期实验(少于30分钟)中使用三卡因。对于更长的成像效果,在单细胞或双细胞阶段注射α-bungarotoxin mRNA可在受精后3天内使鱼瘫痪,而不会影响心血管发育或生理学22。
选择合适的 FEP 管
FEP管有各种直径和厚度可供选择。要成像0-5 dpf鱼,0.8毫米是一个很好的内径;选择厚壁 0.8 x 1.6 mm 管或薄壁 0.8 x 1.2 mm 管。我们建议使用薄壁管;然而,较厚的壁提供了更高的稳定性和刚度,如果样品室具有可能破坏和移动细管的流动介质,则这可能很重要。对于较大的样品,可以使用1.6 x 2.4 mm和2 x 3 mm。
温度和气体交换
斑马鱼胚胎健康的一个重要方面是温度。理想情况下,在成像时将鱼保持在28.5°C,因为环境的温度会影响发育和心率34。
根据我们的经验,通过2%琼脂糖塞的氧气交换只能保持稳定的心率,直到3-4 dpf。因此,在管子上切孔可确保氧气扩散。如果需要,也可以将药物输送到样品中。
暂停心跳。
适当配备的光片显微镜的快速采集速度允许 记录体内跳动的心脏。然而,要获得不受干扰的z-stack,可以减慢或停止心脏。然而,停止心脏会导致心肌放松,并可能导致心脏塌陷6。心跳悬浮液可以通过使用吗啉,低温,肌肉收缩抑制剂或光遗传学来完成。这些方法都有其缺点,必须针对每个实验进行仔细评估。
在一个细胞阶段注射4 ng 沉默心脏(sih) 吗啉可以通过靶向对肉瘤形成至关重要的基因 tnnt2a 来停止心跳35。 sih 斑马鱼没有心跳,只能存活到7 dpf,当胚胎开始依赖循环血液进行氧合时。由于心脏形态发生是由遗传和生物力学力量36驱动的,这些鱼在3 dpf左右出现心脏畸形。
由于Ca2 + 的流量对温度敏感,温度会影响胚胎斑马鱼的心率21。因此,降低成像室中的温度会减慢心跳。停止心跳需要低于15°C的温度。 由于斑马鱼通常保持在28.5°C,因此这种低温只能保持短时间(不到10分钟)。
药物如肌肉收缩的化学抑制剂,2,3-丁二酮2-一氧化二肟(BDM),可以添加到斑马鱼培养基(50 nM37,38)中暂时暂停心跳。BDM使用方便,因为它在15分钟内停止心脏收缩,并且可以洗掉以恢复心脏功能。然而,由于BDM会改变心脏动作电位,因此必须谨慎使用37。
最后,通过用光照射入路的起搏器来操纵和停止在其心肌中表达光门离子通道或泵(如通道视紫红质或卤素视紫红质)的转基因斑马鱼的心脏39,7,40,41,9。
展望
所提出的用于 在体内 研究斑马鱼心脏的优化工具和解决方案允许对超快心脏动力学进行长期,温和的成像。样品包埋可以适应不同的成像方式,例如共聚焦显微镜,双光子显微镜或光学投影断层扫描(OPT)。然而,光片显微镜可能是首选技术,它以足以捕获心脏动力学的速度提供光学切片。虽然该协议侧重于斑马鱼胚胎心脏成像,但我们相信它也可以应用于各种其他样品和实验。将来,如果类似的嵌入和成像技术也可以在发育过程中的后期阶段使用,当心脏更隐蔽,幼虫半透明性更低时,这将是一件有趣的事情。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Madelyn Neufeld 在图 2h 中的插图。这项工作得到了马克斯普朗克学会,莫格里奇研究所,陈扎克伯格倡议和人类前沿科学计划(HFSP)的支持。
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |