אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.
מחקר הלב העוברי נהנה מאוד מהתקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה של יריעת אור ויואו (LSFM). בשילוב עם ההתפתחות החיצונית המהירה, הגנטיקה המתיחה והתמרנות של דג הזברה, דניו ריו, LSFM סיפק תובנות על צורת הלב ותפקוד ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה ללא פוטוטוקסיה משמעותית או הלבנת תמונות. הדמיה של לבבות פועמים מאתגרת טכניקות קיימות להכנת מדגם ומיקרוסקופיה. יש לשמור על דגימה בריאה בשדה ראייה מכווץ ולרכוש תמונות אולטרה-מהירות כדי לפתור את פעימות הלב. כאן אנו מתארים כלים ופתרונות ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo. אנו מדגימים את היישומים של קווים מהונדסים בהירים לתיוג המרכיבים הלבביים ומציגים טכניקות הטמעה ושתקה חדשניות המונעות מומים התפתחותיים ושינויים בקצב הלב. אנו מציעים גם צינור רכישת נתונים וניתוח מותאם להדמיית לב. כל זרימת העבודה המוצגת כאן מתמקדת בהדמיית לב עוברי של דגי זברה, אך ניתן ליישם אותה גם על דגימות וניסויים שונים אחרים.
כדי לחשוף את האירועים המורכבים ואת האינטראקציות בלב הפועם מוקדם, הדמיה vivo של האיבר כולו נדרש. עם פוטוטוקסיות מינימלית 1,2,3, הלבנת פוטו4 נמוכה ומהירות גבוהה, מיקרוסקופיה של יריעות אור התפתחה ככלי ההדמיה העיקרי להתפתחות עוברית ולבית5,6. הוא סיפק תובנות על צורת הלב ותפקוד ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה7,8,9 ואיפשר לחוקרים לדמיין ולעקוב אחר חלקים מתויגים פלואורסצנטיים של הלב במהירות גבוהה, לחקור כוחות המודינמיים, ולעקוב אחר התפתחות הלב ישירות בתוך הגוף של עוברים מתפתחים6,10,11,12.
כדי להגביל במדויק ובאופן רב את דגי הזברה בתחום הראייה, קיימים מגוון פרוטוקולי הטבעה עבור יריעות אור, לטווח הקצר והארוך, כמו גם מדגם יחיד או רב-מדגם13,14,15,16,17,18,19. הפרוטוקול הנפוץ ביותר כרוך בלימובילציה של טריקאין והרכבת אגרוז בתוך צינור זכוכית או פלסטיק. עם זאת, מכיוון שקצב הלב יכול להשתנות עקב הטמפרטורה, חומר ההרדמה והחומר המשובץ המשמשים20,21,22, הדמיית לב דגי זברה דורשת פרוטוקולים ספציפיים ועדינים כדי להבטיח את בריאות המדגם6,8,11,12,20,21,22,23 . להדמיה לטווח קצר (עד שעה), ניתן להרדים את הדג ב-130 מ”ג/ל’ טריקאין ולהטמיע אותו בצינורות אתילן פרופילן פלואורינאט (FEP) עם 0.1% תמיסת אגרוז ותקע, כמתואר ב-Weber et al. 201416. עם זאת, כמו tricaine יכול להוביל פגמים התפתחותיים20,22, פרוטוקולים שונים חייבים לשמש הדמיה לטווח ארוך.
כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה להדמיית לב לטווח ארוך. בעוד יישומי יריעות אור רבים קיימים24, אנו ממליצים להשתמש במדגם תלוי במיקרוסקופ T-SPIM (זיהוי אחד ושתי עדשות תאורה במישור אופקי כאשר המדגם תלוי אנכית במוקד המשותף). זה נותן את חופש התנועה והסיבוב הדרושים למיקום המדגם המדויק. הדגים משותקים על ידי הזרקת 30 pg α-bungarotoxin mRNA בשלב של תא אחד או שניים. α-בנגרוטוקסין הוא ארס נחש המשתק את השרירים מבלי להשפיע על התפתחות הלב וכלי הדם או על הפיזיולוגיה22. להדמיה מדויקת וללא עיוותים, אנו ממליצים על הרכבה של דגים בצינורות העשויים מ- FEP, פולימר עם אינדקס שבירה כמעט זהה למים. אנו דנים כיצד להכין בצורה הטובה ביותר את צינורות FEP על ידי יישור וניקוי אותם לפני ההדמיה. הדגים מותקנים לאחר מכן בצינורות אלה, ראש למטה, במדיה, ואת החלק התחתון של הצינור הוא אטום עם תקע 2% agarose, שבו ראשי דגים לנוח. חיתוך חורים בצינור FEP מקל על החלפת גז ומבטיח צמיחת דגים. ניתן לשמור את הדגים המוטבעים במדיה עד שהם מותקנים על מחזיק דגימה ממש לפני ההדמיה. אנו מציעים גם צינור רכישת נתונים וניתוח להדמיה מהירה לשחזור. יתר על כן, אנו דנים בשימוש של ציטופלסמי לעומת סמן ממברנה קווים מהונדסים עבור תיוג תא לב חזק, כמו גם אפשרויות שונות כדי לעצור את הלב. טכניקות הרכבה אלה מבטיחות את תקינות המדגם תוך מתן אפשרות להגביל את הלב באופן מדויק ורבייה בתחום הראייה.
קווים מהונדסים לתמונה של הלב
איור 6: השוואה בין קווים מהונדסים של דגי זברה ציטופלסמיים וסמן ממברנה. מבט חיצוני-גחוני של לבבות דגי זברה עם 48 כ”ס בתמונה עם LSFM. חצים לבנים מציינים מבנים הנראים רק עם קו מהונדס סמן ממברנה. (א) אות Tg(kdrl:EGFP)32 בציאן בלב ו-(א’) בחדר. (ב) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 אות באדום בלב ו-(ב’) בחדר. ( c,c’) מיזוג של שניהם Tg (kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) ו Tg (kdrl:EGFP) אות. סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הדמיית לב דג הזברה דורשת תיוג מדויק של תאי הלב. בעוד עובי שריר הלב הוא קבוע יחסית בכל התאים, תאים אנדוקרדיים הם עבים סביב הגרעין אבל יש בליטות ממברנה דקה, באזורים מסוימים דק יותר מ 2 מיקרומטר. קווים מהונדסים ציטופלסמיים כגון Tg(kdrl:EGFP)32 מתייגים ביעילות את האזורים סביב גרעיני אנדוקרדי, אך רחוק יותר, הציטופלסמה הדקה אולי לא פולטת מספיק פוטונים לגילוי עם זמני חשיפה כה קצרים, מה שמוביל לחורים מלאכותיים בנתונים (איור 6a). לעומת זאת, קווים מהונדסים של סמן ממברנה כגון Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 יכולים לתייג ביעילות את האנדוקרדיום ולחשוף פרטים נוספים (איור 6b,c). עבור כל ניסוי, בחר בקפידה את הקו הטרנסגני המתאים ביותר.
פירוק דגי זברה
הבחירה בטכניקת ההשתקה תלויה באורך הניסוי ובגיל הדגים לדימוי. Tricaine שימש בדרך כלל עבור השתקת דגי זברה, בעיקר בשל קלות השימוש שלה. ואכן, פשוט הוספת 130 מ”ג / ליטר tricaine למדיית הדגים תוצאות להרדים שלהם ב 10 דקות. כפי שהוא יכול להוביל פגמים התפתחותיים ולהשפיע על פיזיולוגיה הלב20,22, אנו ממליצים להשתמש tricaine רק עבור ניסויים קצרים (פחות מ 30 דקות). להדמיה ארוכה יותר, זריקות mRNA α-בנגרוטוקסין בשלב של תא אחד או שניים משתקות דגים עד 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) מבלי להשפיע על התפתחות הלב וכלי הדם או על פיזיולוגיה22.
בחירת צינורות FEP הנכונים
צינורות FEP זמינים בקוטרים ועוביים שונים. כדי לדמיין 0-5 דג dpf, 0.8 מ”מ הוא קוטר פנימי טוב; בחר או קיר עבה 0.8 x 1.6 מ”מ צינורות או קיר דק 0.8 x 1.2 מ”מ צינורות. אנו ממליצים על צינורות דקים; עם זאת, קירות עבים יותר מציעים יציבות ונוקשות מוגברות, אשר יכול להיות חשוב אם תא המדגם יש מדיה זורמת שיכול לשבש ולהזיז צינור דק. עבור דגימות גדולות יותר, 1.6 x 2.4 מ”מ ו 2 x 3 מ”מ ניתן להשתמש.
חילופי טמפרטורה וגז
היבט חיוני של רווחתו של עובר דג הזברה הוא הטמפרטורה. באופן אידיאלי, לשמור על הדגים ב 28 °C (5 °F) תוך הדמיה, כמו הטמפרטורה של הסביבה משפיעה על ההתפתחות ואת קצב הלב34.
מניסיוננו, החלפת חמצן דרך תקע אגרוז 2% שומרת רק על קצב לב יציב עד 3-4 dpf. לכן, חיתוך חורים בצינור מבטיח דיפוזיה חמצן. זה יכול להיות גם הכרחי עבור משלוח סמים לדגימה אם תרצה.
השעיית פעימות לב.
מהירויות הרכישה המהירות של מיקרוסקופים של יריעות אור מאובזרות כראוי מאפשרות הקלטה של הלב הפועם ב- vivo. עם זאת, כדי לרכוש z-stack ללא הפרעה, אפשר להאט או לעצור את הלב. עם זאת, עצירת הלב מובילה הרפיה שריר הלב ועלול לגרום לקריסת הלב6. השעיית פעימות לב יכולה להיעשות באמצעות מורפולינוס, טמפרטורות נמוכות, מעכב של התכווצות שרירים או אופטוגנטיקה. לכל אחת מהשיטות האלה יש את החסרונות שלה ויש להעריך אותן בקפידה עבור כל ניסוי.
הזרקת 4 ננוגרם של לב שקט (sih) מורפולינו בשלב תא אחד יכול לעצור את פעימות הלב על ידי מיקוד הגן tnnt2a חיוני עבור היווצרות sarcomere35. דגי זברה sih אין פעימות לב רק לשרוד עד 7 dpf, כאשר העוברים מתחילים להסתמך על דם במחזור עבור חמצון. כמו מורפוגנזה הלב מונע על ידי כוחות גנטיים וביומכניים36, דגים אלה מציגים מומים בלב סביב 3 dpf.
כמו הזרימה של Ca2+ הוא רגיש לטמפרטורה, הטמפרטורה משפיעה על קצב הלב בדגי זברה עובריים21. כתוצאה מכך, הורדת הטמפרטורה בתא ההדמיה מאטה את פעימות הלב. עצירת פעימות הלב דורשת טמפרטורות מתחת ל -15 מעלות צלזיוס. כמו דגי זברה נשמרים בדרך כלל ב 28 °C (5 °F), טמפרטורות נמוכות כאלה ניתן לשמור רק לתקופות קצרות (פחות מ 10 דקות).
תרופות כגון מעכבים כימיים של התכווצויות שרירים, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), ניתן להוסיף למדיה דג זברה (50 nM37,38) כדי להשעות את פעימות הלב באופן זמני. BDM נוח לשימוש כפי שהוא מפסיק התכווצות הלב בפחות מ 15 דקות והוא יכול להיות שטף כדי לשחזר את תפקוד הלב. עם זאת, כמו BDM משנה את פוטנציאל הפעולה הלב, יש להשתמש בו בזהירות37.
לבסוף, הלב של דגי זברה מהונדסים המבטאים תעלות יונים מגודרות אור או משאבות כגון channelrhodopsin או הלוהודופסין בשריר הלב שלהם ניתן לתמרן ולעצור על ידי הארת קוצב הלב בדרכי הזרימה עם אור39,7,40,41,9.
Outlook
הכלים והפתרונות הממוטבים שהוצגו לחקר לב דג הזברה ב-vivo מאפשרים הדמיה ארוכת טווח ועדינה של דינמיקת לב אולטרה-מהיר. ניתן להתאים את ההטבעה לדוגמה כך שתתאים לאומדות הדמיה שונות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה דו-פוטונית או טומוגרפיה של הקרנה אופטית (OPT). מיקרוסקופיה של יריעת אור, לעומת זאת, היא ככל הנראה הטכניקה המועדפת המציעה חתך אופטי במהירות מספקת כדי ללכוד את הדינמיקה של הלב. בעוד פרוטוקול זה מתמקד בהדמיית לב עוברי של דגי זברה, אנו מאמינים שניתן ליישם אותו גם על דגימות וניסויים שונים אחרים. יהיה מעניין לראות בעתיד אם ניתן להשתמש בטכניקות הטמעה והדמיה דומות גם בשלבים מאוחרים יותר במהלך ההתפתחות כאשר הלב מוסתר יותר והזחל פחות שקוף.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למדלין נויפלד על האיור באיור 2h. עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלאנק, מכון מורגרידג’ למחקר, יוזמת צ’אן צוקרברג ותוכנית המדע של הגבול האנושי (HFSP).
1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
E3 medium for zebrafish embryos | |||
Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |