Summary

إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة ALS مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخاصة بالمنطقة

Published: August 26, 2021
doi:

Summary

وصفنا طريقة للتمييز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الحبل الشوكي التي يسببها الإنسان وثقافتها المشتركة للتسجيل الكهربيفيزيولوجي.

Abstract

توفر الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) أداة قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر. تعد تسجيلات الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) وسيلة لتسجيل إمكانات المجال الكهربائي من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وتحليل نشاط الشبكة بمرور الوقت. وقد ثبت سابقا أن وجود hiPSC-A المتمايز باستخدام تقنيات لتعزيز النمط الظاهري للخلايا النجمية للحبل الشوكي يحسن النضج والنشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي (MN) عند مقارنتها بتلك المستزرعة بدون hiPSC-A أو في وجود الخلايا النجمية للقوارض. الموصوفة هنا هي طريقة لمشاركة زراعة الحبل الشوكي hiPSC-A مع hiPSC-MN وتسجيل النشاط الكهربي باستخدام تسجيلات MEA. في حين أن بروتوكولات التمايز الموصوفة هنا خاصة بالخلايا النجمية والخلايا العصبية الخاصة إقليميا بالحبل الشوكي ، يمكن تطبيق منصة الاستزراع المشترك على الخلايا النجمية والخلايا العصبية المتباينة بتقنيات خاصة بمصائر أخرى ، بما في ذلك hiPSC-A القشري و hiPSC-N. تهدف هذه البروتوكولات إلى توفير مقايسة فيزيولوجية كهربية للإبلاغ عن تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية وتوفير منصة لاختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في ALS.

Introduction

الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) هي أدوات قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر وتوفر نموذجا متعديا لاستراتيجيات اكتشاف الأدوية1. لقد أثبت الباحثون أن الثقافة المشتركة ل hiPSC-A مع hiPSC-N تعزز النضج المورفولوجي والجزيئي والفيزيولوجي الكهربي والدوائي لكلا النوعين من الخلايا ، مما يولد شبكات عصبية معقدة وتفاعلات الخلايا العصبية النجمية التي تشبه نظيراتها في الجسم الحي 2,3. يمكن لتجارب الاستزراع المشترك المماثلة أن تلخص السمات المميزة لعلم الأحياء المرضي ALS مثل السمية العصبية بوساطة الخلايا النجمية 4,5 وفرط استثارة الخلايا العصبية6. بالإضافة إلى ذلك ، مع التقدم في بروتوكولات التمايز ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC) إلى أنواع فرعية عصبية خاصة بالمنطقة ، بما في ذلك hiPSC-A و hiPSC-N 7,8 القشرية والحبل الشوكي. توفر هذه الاستراتيجيات إمكانية نمذجة أمراض الخلايا العصبية الحركية القشرية والشوكية في ALS بالإضافة إلى التأثير النجمي على كليهما. ومع ذلك ، يتطلب هذا وجود اختبار وظيفي قابل للتكرار لتحديد هذه الآثار.

لقد تبين مؤخرا أن تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) مناسب بشكل خاص للتوصيف الفيزيولوجي الكهربي للثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والنجمية2. على عكس التحليلات الفيزيولوجية الكهربية أحادية الخلية ، تسجل هذه المصفوفات الكهربية عالية الكثافة بشكل سلبي إمكانات المجال خارج الخلية من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية دون تعطيل ظروف الثقافة والحفاظ على سلامة أغشية الخلايا. هذه المنصات مفيدة بشكل خاص لتسجيل النشاط الخلوي والشبكي للثقافات بمرور الوقت واستجابة للتلاعب الدوائي. أخيرا ، عندما يكون وجود الخلايا النجمية متغيرا ثقافيا ، يمكن أن توفر تسجيلات MEA رؤى وظيفية حول التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية 2,9.

يظهر هنا بروتوكول محسن لتمايز hiPSC إلى hiPSC-A الحبل الشوكي والخلايا العصبية الحركية hiPSC (MN) التي تم التحقق من صحتها مسبقا2. ينتج عن بروتوكول تمايز الحبل الشوكي hiPSC-A باستمرار مزارع الخلايا النجمية ، والتي تكون إيجابية لبروتين S100 المرتبط بالكالسيوم B (S100β) ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و Homeobox B4 (HOXB4) في ما يصل إلى 80٪ و 50٪ و 90٪ من الخلايا ، على التوالي ، مما يشير إلى نضج مواصفات الحبل الدبقي والشوكي 2,10 . يولد بروتوكول التمايز hiPSC-MN خلايا عصبية إيجابية بنسبة >90٪ ل الكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) ، مما يوحي بهوية الخلايا العصبية الحركية ألفاالناضجة 2. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول تقنيات لتوليد الثقافات المشتركة hiPSC-A / MN التي ثبت سابقا أنها تؤدي إلى خلايا عصبية ذات تعقيد مورفولوجي معزز من خلال تحليل شول والفحص المجهري المناعي عند مقارنتها بالثقافات العصبية بدون الخلايا النجمية أو مع الخلايا النجمية للقوارض2. في حين أن هذه الأوصاف خاصة ب hiPSC-A و hiPSC-N للحبل الشوكي ، فإن الميزة الفريدة هي أن الثقافة المستقلة الأولية للخلايا النجمية والخلايا العصبية متبوعة بخطوات للثقافة المشتركة في نقاط زمنية لاحقة يمكن ترجمتها لدراسة آثار تفاعلات الخلايا العصبية والنجمية من مناطق محددة أخرى بالإضافة إلى الخلايا الخاصة بالمرض 7,8 . وأخيرا، يصف البروتوكول كيفية زراعة هذه الثقافات على لوحات MEA بحيث يمكن دراسة النشاط الوظيفي كعامل لتكوين الاستزراع المشترك بمرور الوقت مع القدرة على معالجة التكوين الخلوي وكذلك ظروف الثقافة.

الهدف من هذه البروتوكولات هو توفير اختبار وظيفي للتحقيق في تفاعلات الخلايا العصبية النجمية ، وفحص التغيرات الخاصة بالمرض ، واختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في مجال ALS. يتم توفير تعليمات الفيديو للخطوات الأكثر تحديا في هذا البروتوكول.

Protocol

1. إعداد وسائط زراعة الخلية قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا الفردية باستخدام التراكيب المذكورة في الجدول 1. قم بخلط وتعقيم الوسائط في زجاجات مفلترة سعة 500 مل ، وقم بتخزينها محمية من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. 2. الحفاظ على الخلايا الجذعية …

Representative Results

تم توضيح بروتوكول نمط الحبل الشوكي لتوليد hiPSC-MN و hiPSC-A في الحبل الشوكي في الشكل 1. في هذا البروتوكول ، يتم الحفاظ على hiPSCs وتمريرها كمستعمرات غير متقاربة (الشكل 2 أ). يبدأ تكوين الخلايا العصبية (الحث العصبي) من خلال تثبيط SMAD المزدوج عن طريق إضافة LDN193189 و SB431542 ، مم?…

Discussion

حتى الآن ، وجدت الطرق القائمة على hiPSC و MEA للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للمزارع المشتركة بين الخلايا العصبية النجمية تطبيقا محدودا في مجال ALS6 ولا تزال غير موجودة في المنصات البشرية بالكامل ، على عكس استخدامها الأكثر انتشارا للنمذجة المختبرية للصرع9. ومع ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه المخطوطة بما يلي: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH) ، 2020 جائزة التطوير الوظيفي للعلماء السريريين لمؤسسة دوريس ديوك الخيرية (CWH). 1R01NS117604-01NIH / NINDS (NJM) ، DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM) ، 2019 MSCRFD 5122 (NJM). نشكر الدكتورة رها دستغيب والدكتور نورمان هوغي على توفير منصة MEA وبرامج تحليل البيانات التي استخدمناها للتحقق من صحة منصة الفيزيولوجيا الكهربية الموصوفة. نود أن نشكر خليل روست على مساعدتهم في عرض البروتوكول والتصوير.

Materials

10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix – Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B – B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N – N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film – Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease – Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Play Video

Cite This Article
Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O’Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

View Video