Summary

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

Published: August 13, 2021
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Summary

多能O9-1神経堤細胞と様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用して 、インビトロで 機械的信号を研究するための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明します。

Abstract

神経堤細胞(NCC)は、さまざまな臓器や組織を生み出す幅広い細胞型に移行し、分化することができる脊椎動物胚多能細胞です。組織の剛性は、機械的な力、NCC分化に重要な役割を果たす物理的な手がかりを生成します。しかし、メカニズムは不明のままです。ここで説明する方法は、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルの最適化された生成、そのような剛性の正確な測定、 および生体NCCを 模倣するNCCラインであるO9-1細胞における機械的信号の影響の評価に関する詳細な情報を提供する。

ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を用いて測定し、それに応じて異なる剛性レベルを示した。様々な剛性のヒドロゲルに培養されたO9-1 NCCは、ストレス線維の異なる細胞形態および遺伝子発現を示し、機械的シグナル変化によって引き起こされる生物学的効果が異なっている。さらに、ヒドロゲル剛性を変化させることで、ゲル剛性を変化させ、NCCの分子および遺伝的調節を分析することによって機械的シグナル伝達を操作する効率的な インビトロ システムをもたらしたことが確立 された。したがって、この in vitro システムは、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と化学シグナルとの相互作用を研究するための強力なツールであり、研究者は神経堤の発達と疾患の分子および遺伝的メカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。

Introduction

神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物胚発生時の幹細胞群であり、様々な臓器や組織の発達に寄与する著しい能力を有する。NCCは、NCC1,2の軸方向起点の位置や局所的環境誘導に応じて、感覚ニューロン、軟骨、骨、メラノサイト、平滑筋細胞を含む異なる細胞タイプに分化することができる。広範囲の細胞型に分化する能力を持つ、神経堤(NC)の発達の任意の段階で調節不全を引き起こす遺伝的異常は、多数の先天性疾患に至る可能性がある2。例えば、NCCの形成、移動、および発達中の摂動は、神経経皮症1,3として総称して知られる発達障害につながる。これらの疾患は、NCC形成における障害による頭蓋顔面欠損(トレチャー・コリンズ症候群など)から、黒色腫3、4、5、6に見られるようにNCC転移性回遊能力に起因する様々な癌の発症まで多岐にわたる。過去数十年にわたり、研究者は開発および疾患におけるNCCの役割とメカニズムについて顕著な発見を行い、その大半は化学信号7,8に焦点を当てています。最近では、機械的信号は、NCC開発9、10において重要だが十分に理解されていない役割を果たしていることが示されている。

NCCの環境的な手掛かりは、NCC分化を様々な細胞タイプに規制するなど、開発中に重要な役割を果たします。環境の手掛かり、例えば、物理的な手がかりは、機能多様化などの極めて重要な行動および細胞応答に影響を与える。メカノトランスダクションは、細胞が様々な生物学的プロセスを維持するためにそれらの手がかりを感知し、応答することを可能にする2.NCCは、隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)のような異なる基質に囲まれており、恒常性を維持し、運命決定、増殖、およびアポトーシス11を通じて変化に適応するために機械的刺激を生じさせることができる。メカノトランスダクションは、機械的細胞外刺激の感覚成分が生じる形質膜から始まり、細胞12の細胞内調節をもたらす。インテグリン、焦点接着、および、剪断力、応力、および周囲の基質の剛性などの機械的信号を、細胞応答12を生成する化学信号に、プラズマ膜リレーの接合部。細胞膜から最終的な細胞調節への化学信号の中継は、分化などの生物の重要なプロセスを確定するために異なるシグナル伝達経路を介して行われます。

いくつかの研究は、基質剛性からの機械的シグナル伝達が細胞分化13、14に役割を果たしていることを示唆している。例えば、これまでの研究では、脳組織と同様の硬直性を有する軟質基質上で成長した間葉系幹細胞(MCC)(0.1〜1.0kPa)が神経細胞分化15,16を生じることが示されている。しかし、筋肉の剛性を模倣した8-17 kPa基質上で増殖するとより多くのMSCが筋細胞様細胞に分化し、一方、MSCを硬質基質上で培養した際に骨芽細胞様分化が観察された(25-40kPa)15,16。メカノトランスダクションの意義は、癌、心血管疾患、骨粗鬆症17、18、19を含む重篤な発達上の欠陥および疾患につながる可能性のある機械的シグナル伝達経路の不規則性および異常によって強調される。癌では、正常な乳房組織は軟らかく、乳房癌のリスクは、硬く、密な乳房組織、乳房腫瘍15に似た環境において増加する。この知見により、生体信号がNCC開発に及ぼす影響を、in vitroシステムを通じて基質剛性を簡単に操作することで研究することができ、NC関連疾患の進行と病因の基礎を理解する上でさらなる利点と可能性を提供します。

NCCにおける機械的信号の影響を調べ、従来公表された方法の最適化と異なる機械的信号20,21に対するNCCの応答評価に基づくNCCの効率的なインビトロシステムを確立した。ヒドロゲルの剛性の調製とNCCにおける機械的シグナリングの影響の評価を行うための詳細なプロトコルが提供されました。これを達成するために、O9-1 NCCは、硬い対ソフトヒドロゲルに応答して効果と変化を研究するためにNCモデルとして利用されています。O9-1 NCCは、8.5日目にマウス胚(E)から分離された安定したNC細胞株です。O9-1 NCC は、定義された分化メディア22の各種 NC 由来細胞タイプに分化できるため、インビボで NCC を模倣しています。NCCの機械的シグナル伝達を研究するために、マトリックス基質を、所望の剛性を達成するために、所望の剛性を達成するために、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液の様々な濃度から調整可能な弾性で作製した、生物学的基質剛性20、21、23と相関する。NCC用マトリックス基板の条件を最適化するために、具体的にはO9-1細胞は、以前に公開されたプロトコル20から改変を行った。このプロトコルで行われた1つの変更は、コラーゲンIのヒドロゲルをインキュベートし、50mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸に希釈し、一晩で37°Cで行った。酢酸の低pHは均質な分布と高いコラーゲンIの組み込みをもたらし、したがってECMタンパク質24のより均一な付着を可能にする。また、ウシ胎児血清(FBS)との組み合わせは、インキュベーターにヒドロゲルを貯蔵する前に、それぞれリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で10%および5%の濃度で使用した。10%25の濃度で細胞増殖および分化を促進する能力のために、FBSへの追加サプリメントとして馬血清を使用した。

この方法により、生物環境をECMタンパク質コーティング(例えば、コラーゲンI)によって模倣し、NCCが成長し、20,21を生き残るための正確なインビトロ環境を作り出した。調製されたヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を介して定量的に分析した、弾性率26を描写するよく知られた技術である。NCCに対する異なる剛性レベルの影響を研究するために、野生型O9-1細胞を培養し、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対する免疫蛍光(IF)染色用のヒドロゲルに調製し、基質剛性の変化に応じて細胞接着および形態の違いを示した。このインビトロシステムを利用して、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と他の化学信号との相互作用を研究し、NCCと機械的シグナル伝達の関係を深く理解することができます。

Protocol

1. ヒドロゲル調製物 注:すべてのステップは、無菌を維持するために使用する前にエタノールと紫外線(UV)滅菌で消毒された細胞培養フードで行う必要があります。ピンセットやピペットなどの工具にはエタノールを散布する必要があります。緩衝液はまた無菌濾過されなければならない。 アミノシランコーティングガラスカバーリップの調製 所望の数のガ?…

Representative Results

AFMとヘルツモデルによるヒドロゲル調製と剛性評価ここでは、アクリルアミドとビスアクリルアミドの比率を調節することによって、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを生成するための詳細なプロトコルが提供される。しかし、ポリアクリルアミドヒドロゲルは、ECMタンパク質の不足のために細胞の接着の準備ができていません。このように、スルホ-SANPAHは、リン…

Discussion

現在の研究の目的は、NCCにおける機械的信号の影響をよりよく理解するための効果的かつ効率的な インビトロ システムを提供することです。上記のステップバイステップのプロトコルに従うだけでなく、研究者はO9-1 NCCの細胞培養がヒドロゲルの調製に使用されるガラスカバーリップの種類によって影響を受けることを覚えておいてください。例えば、特定のタイプのガラスカバース…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

テキサス大学ヘルスサイエンスセンターの原子間力顕微鏡-UTコア施設の運営者であるアナ・マリア・ザスケ博士は、このプロジェクトでAFMに貢献した専門知識を持ってくれたことに感謝します。また、国立衛生研究所(K01DE026561、R03DE025873、R01DE029014、R56HL142704、R01HL142704)からJ.Wangへの資金源に感謝します。

Materials

12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

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