Summary

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Published: June 01, 2021
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Abstract

Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit dem Ribosomenprofile erstellt, spezifische mRNAs identifiziert werden können, die von Ribosomen übersetzt werden, und Polysomen-assoziierte Faktoren analysiert werden können. Während automatisierte Gradientenhersteller und Gradientenfraktionierungssysteme häufig mit dieser Technik verwendet werden, sind diese Systeme im Allgemeinen teuer und können für Laboratorien, die über begrenzte Ressourcen verfügen oder die Kosten aufgrund ihrer seltenen oder gelegentlichen Notwendigkeit, diese Methode für ihre Forschung durchzuführen, unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Polysomenprofilen mit Standardgeräten vorgestellt, die in den meisten molekularbiologischen Laboratorien ohne spezielle Fraktionierungsinstrumente verfügbar sind. Darüber hinaus wird ein Vergleich von Polysomenprofilen bereitgestellt, die mit und ohne Gradientenfraktionierungssystem erzeugt wurden. Strategien zur Optimierung und Herstellung reproduzierbarer Polysomenprofile werden diskutiert. Saccharomyces cerevisiae wird in diesem Protokoll als Modellorganismus verwendet. Dieses Protokoll kann jedoch leicht modifiziert und angepasst werden, um Ribosomenprofile für viele verschiedene Organismen und Zelltypen zu erstellen.

Introduction

Ribosomen sind Mega-Dalton-Ribonukleoproteinkomplexe, die den grundlegenden Prozess der Übersetzung von mRNA in Proteine durchführen. Ribosomen sind für die Synthese aller Proteine innerhalb einer Zelle verantwortlich. Eukaryotische Ribosomen umfassen zwei Untereinheiten, die entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten als kleine ribosomale Untereinheit (40S) und große ribosomale Untereinheit (60S) bezeichnet werden. Das vollständig zusammengesetzte Ribosom wird als 80S-Monosom bezeichnet. Polysomen sind Gruppen von Ribosomen, die an der Übersetzung eines einzelnen mRNA-Moleküls beteiligt sind. Die Polysomenfraktionierung durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation ist eine leistungsstarke Methode, um Ribosomenprofile zu erstellen, spezifische mRNAs zu identifizieren, die mit der Translation von Ribosomen assoziiert sind, und Polysomen-assoziierte Faktorenzu analysieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Diese Technik wird häufig verwendet, um Polysomen von einzelnen Ribosomen, ribosomalen Untereinheiten und Boten-Ribonukleoproteinpartikeln zu trennen. Die durch Fraktionierung erhaltenen Profile können wertvolle Informationen über die Translationsaktivität der Polysomen14 und den Assemblierungsstatus der Ribosomen15,16,17 liefern.

Ribosomenanordnung ist ein sehr komplexer Prozess, der durch eine Gruppe von Proteinen erleichtert wird, die als Ribosomen-Assemblierungsfaktoren 18,19,20,21 bekannt sind. Diese Faktoren erfüllen eine breite Palette von Funktionen während der Ribosomenbiogenese durch Wechselwirkungen mit vielen anderen Proteinen, einschließlich ATPasen, Endo- und Exonukleasen, GTPasen, RNA-Helikasen und RNA-bindenden Proteinen22. Die Polysomenfraktionierung war ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle dieser Faktoren bei der Ribosomenanordnung zu untersuchen. Zum Beispiel wurde diese Methode verwendet, um zu zeigen, wie Mutationen in der Polynukleotidkinase Grc3, einem prä-rRNA-Verarbeitungsfaktor, den Ribosomenzusammenbauprozess negativ beeinflussen können17,23. Die Polysomenprofilierung hat auch hervorgehoben und gezeigt, dass die konservierten Motive in der ATPase Rix7 für die Ribosomenproduktion16 unerlässlich sind.

Das Verfahren zur Polysomenfraktionierung beginnt mit der Herstellung löslicher Zelllysate aus Zellen von Interesse. Das Lysat enthält RNA, ribosomale Untereinheiten und Polysomen sowie andere lösliche zelluläre Komponenten. In einem Ultrazentrifugenröhrchen wird ein kontinuierlicher, linearer Saccharosegradient erzeugt. Die lösliche Fraktion des Zelllysats wird sanft auf die Oberseite des Saccharosegradientenröhrchens geladen. Das beladene Gradientenrohr wird dann einer Zentrifugation unterzogen, die die zellulären Komponenten innerhalb des Saccharosegradienten durch die Schwerkraft nach Größe trennt. Die größeren Komponenten fahren weiter in den Gradienten hinein als die kleineren Komponenten. Die Oberseite des Gradienten beherbergt die kleineren, langsamer reisenden Zellkomponenten, während sich die größeren, schneller reisenden Zellkomponenten unten befinden. Nach der Zentrifugation wird der Inhalt des Röhrchens als Fraktionen gesammelt. Diese Methode trennt effektiv ribosomale Untereinheiten, Monosomen und Polysomen. Die optische Dichte jeder Fraktion wird dann durch Messung der spektralen Absorption bei einer Wellenlänge von 254 nm bestimmt. Die Darstellung von Absorption vs. Fraktionszahl ergibt ein Polysomenprofil.

Lineare Saccharosedichtegradienten können mit einem Gradientenmacher erzeugt werden. Nach der Zentrifugation werden die Gradienten oft fraktioniert und die Absorptionen mit einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem 3,7,13,24,25 gemessen. Während diese Systeme sehr gut funktionieren, um Polysomenprofile herzustellen, sind sie teuer und können für einige Labore unerschwinglich sein. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von Polysomenprofilen ohne den Einsatz dieser Instrumente vorgestellt. Stattdessen verwendet dieses Protokoll Geräte, die normalerweise in den meisten molekularbiologischen Laboratorien verfügbar sind.

Protocol

1. Herstellung von 7% – 47% Saccharosegradienten HINWEIS: Der lineare Bereich des Saccharosegradienten kann je nach verwendetem Zelltyp modifiziert werden, um eine bessere Trennung zu erreichen. Dieses Protokoll ist für Polysomenprofile für S. cerevisiae optimiert. Stammlösungen von 7% und 47% Saccharose in Saccharosegradientenpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mMMgCl2 und 1 mM DTT) herzustellen. Filter sterilisieren die Saccharose-Stammlösungen durc…

Representative Results

In Abbildung 3 sind drei repräsentative Polysomenprofile dargestellt. Alle Profile stammen vom gleichen Hefestamm. Ein typisches Polysomenprofil hat gut aufgelöste Peaks für die ribosomalen Untereinheiten 40S, 60S und 80S sowie Polysomen. Der Kamm jeder ribosomalen Untereinheit und jedes Polysomenpeaks ist auf jedem Profil sichtbar (Abbildung 3). Ein repräsentatives Profil eines automatisierten Dichtefraktionierungssystems ist in Abbildu…

Discussion

Hier wurde eine Methode beschrieben, um Polysomenprofile ohne den Einsatz teurer automatisierter Fraktionierungssysteme zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie die Polysomenprofilierung für Labore zugänglich macht, die nicht über automatisierte Fraktionierungssysteme verfügen. Die Hauptnachteile dieses Protokolls sind die langwierige Handfraktionierung und die reduzierte Empfindlichkeit im Vergleich zum dedizierten Dichtefraktionierungssystem.

Dieses Protokoll bein…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Percy Tumbale und Dr. Melissa Wells für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; Das US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 bis R.E.S).

Materials

Automatic Fractionator Brandel
Clariostar Multimode Plate Reader BMG Labtech
Cycloheximide Sigma Aldrich C7698
Dithiothreitol Invitrogen 15508-013
Glass Beads, acid washed Sigma Aldrich G8772 425–600 μm
Heparin Sigma Aldrich H4784
Magnesium Chloride, 1 M KD Medical CAC-5290
Needle, 22 G, Metal Hub Hamilton Company 7748-08 custom length 9 inches, point style 3
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polypropylene Centrifuge tubes Beckman Coulter 331372
Polypropylene Test Tube Peg Rack Fisher Scientific 14-810-54A
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33228
Qubit RNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32855
RNAse Inhibitor Applied Biosystems N8080119
Sucrose Sigma Aldrich S0389
SW41 Swinging Bucket Rotor Pkg Beckman Coulter 331336
Syringe, 3 mL Coviden 888151394
Tris, 1 M,  pH 7.4 KD Medical RGF-3340
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
UV-Star Microplate, 96 wells Greiner Bio-One 655801

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Cite This Article
Sobhany, M., Stanley, R. E. Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems. J. Vis. Exp. (172), e62680, doi:10.3791/62680 (2021).

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