Summary

Extraction et visualisation d’agrégats protéiques après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique

Published: June 29, 2021
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Summary

Ce protocole décrit l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien protéotoxique. Suivre cette procédure permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques in vivo dans différentes souches bactériennes et/ou entre les traitements.

Abstract

L’exposition des organismes vivants à des stress environnementaux et cellulaires provoque souvent des perturbations dans l’homéostasie des protéines et peut entraîner une agrégation des protéines. L’accumulation d’agrégats de protéines dans les cellules bactériennes peut entraîner des altérations significatives du comportement phénotypique cellulaire, notamment une réduction des taux de croissance, de la résistance au stress et de la virulence. Plusieurs procédures expérimentales existent pour l’examen de ces phénotypes médiés par les facteurs de stress. Cet article décrit un essai optimisé pour l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles de différentes souches d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien contenant de l’argent-ruthénium. Ce composé est connu pour générer des espèces réactives de l’oxygène et provoque une agrégation protéique généralisée.

La méthode combine une séparation basée sur la centrifugation des agrégats de protéines et des protéines solubles des cellules traitées et non traitées avec une séparation et une visualisation ultérieures par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) et coloration de Coomassie. Cette approche est simple, rapide et permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques dans différentes souches d’E. coli. La méthodologie a un large éventail d’applications, y compris la possibilité d’étudier l’impact d’autres antimicrobiens protéotoxiques sur l’agrégation in vivo des protéines dans un large éventail de bactéries. De plus, le protocole peut être utilisé pour identifier les gènes qui contribuent à une résistance accrue aux substances protéotoxiques. Les bandes de gel peuvent être utilisées pour l’identification ultérieure des protéines particulièrement sujettes à l’agrégation.

Introduction

Les bactéries sont inévitablement exposées à une myriade de stress environnementaux, y compris un faible pH (par exemple, dans l’estomac des mammifères)1,2, des espèces réactives de l’oxygène et du chlore (ROS / RCS) (par exemple, lors d’une explosion oxydative dans les phagocytes)3,4,5, des températures élevées (par exemple, dans les sources chaudes ou pendant un choc thermique)6,7, et plusieurs antimicrobiens puissants (par exemple, AGXX utilisé dans ce protocole)8. Les protéines sont particulièrement vulnérables à l’un de ces facteurs de stress, et l’exposition peut provoquer un dépliage / un mauvais repliement des protéines qui s’agréger ensuite. Tous les organismes emploient des systèmes de protection qui leur permettent de faire face au mauvais repliement des protéines9. Cependant, un stress sévère peut submerger la machinerie de contrôle de la qualité des protéines et perturber la structure secondaire et / ou tertiaire des protéines, ce qui finit par inactiver les protéines. En conséquence, les agrégats de protéines peuvent gravement altérer les fonctions cellulaires critiques nécessaires à la croissance et à la survie bactériennes, à la résistance au stress et à la virulence10. Par conséquent, la recherche axée sur l’agrégation des protéines et ses conséquences sur les bactéries est un sujet pertinent en raison de son impact potentiel sur le contrôle des maladies infectieuses.

Le déploiement et l’agrégation des protéines induites par la chaleur sont souvent réversibles7. En revanche, d’autres stress protéotoxiques, tels que le stress oxydatif, peuvent provoquer des modifications irréversibles des protéines par l’oxydation de chaînes latérales d’acides aminés spécifiques, entraînant un dépliage / mauvais repliement des protéines et, éventuellement, une agrégation des protéines4. La formation induite par le stress d’agrégats protéiques insolubles a été largement étudiée dans le contexte des chaperons moléculaires et de leurs fonctions protectrices chez les levures et les bactéries11,12,13. Plusieurs protocoles ont été publiés qui utilisent une variété de techniques biochimiques pour l’isolement et l’analyse des agrégats de protéines insolubles14,15,16,17. Les protocoles existants ont principalement été utilisés pour étudier l’agrégation des protéines bactériennes lors d’un choc thermique et/ou l’identification de chaperons moléculaires. Bien que ces protocoles aient certainement été une avancée dans le domaine, il y a quelques inconvénients majeurs dans les procédures expérimentales car ils nécessitent (i) un grand volume de culture bactérienne allant jusqu’à10 L 14,17, (ii) des processus de perturbation physique compliqués, y compris l’utilisation de perturbateurs cellulaires, Français presse et / ou sonication14,15,17, ou (iii) des répétitions chronophages étapes de lavage et d’incubation15,16,17.

Cet article décrit un protocole modifié qui vise à remédier aux limites des approches précédentes et permet l’analyse de la quantité d’agrégats de protéines formés dans deux souches différentes d’Escherichia coli après traitement avec un revêtement de surface antimicrobien protéotoxique. Le revêtement est composé de métal-argent (Ag) et de ruthénium (Ru) conditionnés avec de l’acide ascorbique, et son activité antimicrobienne est obtenue par la génération d’espèces réactives de l’oxygène8,18. On trouvera ici une description détaillée de la préparation de la culture bactérienne après traitement avec le composé antimicrobien et une comparaison de l’état d’agrégation des protéines lors de l’exposition de deux souches d’E. coli présentant des profils de sensibilité distincts à l’augmentation de la concentration de l’antimicrobien. La méthode décrite est peu coûteuse, rapide et reproductible et peut être utilisée pour étudier l’agrégation des protéines en présence d’autres composés protéotoxiques. En outre, le protocole peut être modifié pour analyser l’impact des délétions de gènes spécifiques sur l’agrégation des protéines dans une variété de bactéries différentes.

Protocol

1. Traitement du stress des souches d’E. coli MG1655 et CFT073 Inoculer 5 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec une seule colonie de souche commensale d’E. coli MG1655 et de souche uropathogène E. coli (UPEC) CFT073, respectivement, et incuber pendant 14 à 16 h (pendant la nuit) à 37 °C et 300 tr/min.REMARQUE: Escherichia coli CFT073 est un agent pathogène humain. La manipulation du CFT073 doit être effectuée avec des mesures de biosécurité appropriées dans…

Representative Results

Figure 6: Résultats représentatifs de l’agrégation protéique induite par les antimicrobiens dans la souche commensale Mg1655 d’Escherichia coli et la souche CFT073 de l’UPEC. Les souches d’E. coli MG1655 et CFT073 ont été cultivées à 37 °C et de 300 tr/min àOD 600= 0,5-0,55 dans un milieu MOPS-g avant d’être t…

Discussion

Ce protocole décrit une méthodologie optimisée pour l’analyse de la formation d’agrégats protéiques après traitement de différentes souches d’E. coli avec un antimicrobien protéotoxique. Le protocole permet l’extraction simultanée de fractions protéiques insolubles et solubles à partir de cellules E. coli traitées et non traitées. Par rapport aux protocoles existants pour l’isolement des agrégats de protéines à partir des cellules14,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage de l’Illinois State University School of Biological Sciences, l’Illinois State University New Faculty Initiative Grant et la subvention NIAID R15AI164585 (à J.-U. D.). G.M.A. a été soutenu par l’Illinois State University Undergraduate Research Support Program (à G.M.A.). K. P. H. a été soutenu par une bourse RISE fournie par le Service allemand d’échanges universitaires (DAAD). Les auteurs remercient le Dr Uwe Landau et le Dr Carsten Meyer de Largentech Vertriebs GmbH pour avoir fourni la poudre AGXX. Les figures 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4et Figure 5 ont été générées avec Biorender.

Materials

Chemicals/Reagents
Acetone Fisher Scientific 67-64-1
30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 Bio-Rad 1610156
Ammonium persulfate Millipore Sigma A3678-100G
Benzonase nuclease Sigma E1014-5KU
Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa GoldBio P008-500
β-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-100ML
Bromophenol blue GoldBio B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250 MP Biomedicals LLC 821616
D-Glucose Millipore Sigma G8270-1KG
D-Sucrose Acros Organics 57-50-1
Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich SLBT9686
Glacial Acetic acid Millipore Sigma ARK2183-1L
Glycerol, 99% Sigma-Aldrich G5516-1L
Glycine GoldBio G-630-1
Hydrochloric acid, ACS reagent Sigma-Aldrich 320331-2.5L
Isopropanol (2-Propanol) Sigma 402893-2.5L
LB broth (Miller) Millipore Sigma L3522-1KG
LB broth with agar (Miller) Millipore Sigma L2897-1KG
Lysozyme GoldBio L-040-25
10x MOPS Buffer Teknova M2101
Nonidet P-40 Thomas Scientific 9036-19-5
Potassium phosphate, dibasic Sigma-Aldrich P3786-1KG
Potassium phosphate, monobasic Acros Organics 7778-77-0
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-500G
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Millipore Sigma T9281-50ML
Thiamine Sigma-Aldrich T4625-100G
100% Trichloroacetic acid Millipore Sigma T6399-100G
Tris base GoldBio T-400-1
Material/Equipment
Centrifuge tubes (15 mL) Alkali Scientific JABG-1019
Erlenmeyer flask (125 mL) Carolina 726686
Erlenmeyer flask (500 mL) Carolina 726694
Freezer: -80 °C Fisher Scientific
Glass beads (0.5 mm) BioSpec Products 1107-9105
Microcentrifuge Hermle Z216MK
Microcentriguge tubes (1.7 mL) VWR International 87003-294
Microcentriguge tubes (2.0 mL) Axygen Maxiclear Microtubes MCT-200-C
Plastic cuvettes Fischer Scientific 14-377-012
Power supply ThermoFisher Scientific EC105
Rocker Alkali Scientific RS7235
Shaking incubator (37 °C) Benchmark Scientific
Small glass plate Bio-Rad 1653311
Spacer plates (1 mm) Bio-Rad 1653308
Spectrophotometer Thermoscientific 3339053
Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes Beckman-Coulter
Vertical gel electrophoresis chamber Bio-Rad 1658004
Vortexer Fisher Vortex Genie 2 12-812
Thermomixer Benchmark Scientific H5000-HC
10 well comb Bio-Rad 1653359

References

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Sultana, S., Anderson, G. M., Hoffmann, K. P., Dahl, J. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. Exp. (172), e62628, doi:10.3791/62628 (2021).

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