蛋白质和含胺配体可与氰化试剂、1-氰化物-4-二甲基甲基苯丙胺四氟溴酸酯(CDAP)激活的多糖共价相关,形成共价蛋白(利甘)-多糖结合体。本文描述了在 0 °C 和变 pH 值下执行受控 CDAP 激活以及执行激活多糖后续结合的改进协议。
结合疫苗是疫苗学的显著进步。对于多糖结合疫苗的制备,多糖可以方便地功能化,并使用1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟溴酸酯(CDAP)与疫苗载体蛋白连接,这是一种易于处理的氰化物试剂。CDAP 通过在 pH 7-9 中与碳水化合物羟基组发生反应来激活多糖。CDAP 的稳定性和反应性高度依赖 pH 值。由于CDAP的水解作用,反应的pH值在激活过程中也会降低,这使得良好的pH值控制成为可重复激活的关键。原始 CDAP 激活协议是在室温下以未缓冲的 pH 9 解决方案执行的。
由于在这种情况下(<3分钟)下快速反应,以及伴随快速CDAP水解的快速pH值下降,在短时间内快速调整和维持目标反应pH值是很困难。此处描述的改进协议在 0 °C 下执行,可减慢 CDAP 水解速度,并将激活时间从 3 分钟延长至 ±15 分钟。二甲基亚胺(DMAP)也被用作缓冲,在添加CDAP试剂之前,预先调整多糖溶液到目标激活pH值。反应时间越长,加上 CDAP 水解速度较慢,以及使用 DMAP 缓冲器,使得在整个激活过程的整个持续时间内保持激活 pH 值更加容易。改进的协议使激活过程不那么狂热,更易重复,更易于扩展。
结合疫苗,如那些由多糖共同与载体蛋白共同组成的疫苗,是疫苗学1,2的显著进展之一。多糖作为T细胞独立的抗原,在婴儿中免疫力差,不会诱导记忆、类切换或抗体的亲和力成熟。这些缺点在多糖结合疫苗4中得到克服。由于大多数多糖没有方便的化学处理来结合,因此必须首先对它们进行反应或”激活”。然后,激活的多糖直接与蛋白质(或改性蛋白质)连接,或在结合4之前功能化,以进行额外的分化。大多数获得许可的多糖结合疫苗使用还原性凝结或氰化来激活多糖羟基。氰化物溴化物(CNBr)是一种试剂,以前曾用于激活色谱树脂,最初用于多糖衍生。然而,CNBr 需要高 pH 值(通常为 + pH 10.5 或更高)来部分脱质多糖羟基,以便它们足够嗜核,能够攻击氰化物组。高pH值可能不利于碱性实验室多糖,CNBr和最初形成的活性氰化物在如此高的pH值下都不够稳定。
CDAP (1-氰化物-4-二甲基丙胺四氟化物;图1)由李斯等人介绍,用作氰化剂,用于激活多糖5,6。CDAP 是结晶的,易于处理,被发现以低于 CNBr 的 pH 值激活多糖,并且侧反应更少。与 CNBr 不同,CDAP 激活的多糖可以直接与蛋白质结合,简化合成过程。CDAP 激活的多糖可以使用二胺(例如六烷二胺)或二氢酰胺(例如,二氢化二胺、ADH)功能化,以制造氨基或氢化物衍生的多糖。同位素高浓度用于抑制多糖的交联。然后,氨基多糖可以使用用于蛋白质结合的无数技术进行结合。海德拉齐德衍生的多糖通常与使用碳水化合物试剂(例如,1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳水化合物酰胺(EDAC)7的蛋白质耦合。Lees 等人8描述了 CDAP 多糖激活的进一步优化,并已纳入此处描述的协议中。
CDAP 结合概述
CDAP 协议可概念化为两个阶段:(1) 多糖的激活和 (2) 活化多糖与蛋白质或配体的结合(图 2)。第一步的目标是高效激活多糖,而第二步的目标是有效地与激活的多糖结合。激活的多糖将两个步骤连在一起。这种概念化有助于专注于每个步骤的关键要素。 图2 扩展了这一概念化,显示了所需的激活和耦合反应,以及水解反应和侧反应。
在激活阶段,三个主要问题是CDAP稳定性、CDAP与多糖羟基的反应以及活性多糖的稳定性(图3)。CDAP 水解随 pH 值增加,活化多糖的水解和侧反应也随之增加。但是,通过增加 pH 值,可促进多糖的 CDAP 反应。使用 CDAP 高效激活多糖需要在 1) 多糖和 CDAP 的反应和 2) 试剂和激活的多糖的水解和侧反应之间取得平衡。
在 Lees 等人描述的原始 CDAP 激活协议中,多糖的 CDAP 激活是在室温下在未缓冲的 pH 9 溶液中进行的。在这种情况下,激活速度很快,激活将在 3 分钟内完成。反应的同时,CDAP也迅速水解,导致未缓冲反应溶液的快速pH值下降。在如此短的时间内快速提高并保持目标值的反应 pH 值是很具有挑战性的。在描述的协议中,激活是通过将 CDAP 从 100 毫克/mL 库存溶液添加到未缓冲的多糖溶液中来执行的。30年代后,pH值被提升为”等量的0.2M三聚氰胺”。然后在激活反应中加入2.5分钟后结合的蛋白质。值得注意的是,激活步骤的 pH 值没有得到很好的控制,并且很可能最初超过了目标 pH 值。需要快速 pH 调整的快速反应使激活过程难以控制,难以扩大规模。
与原始协议相比,此处描述的修改协议有两个主要改进。首先,在添加 CDAP 之前,多糖溶液的 pH 值经过预先调整,以达到目标激活 pH 值,使用 DMAP 作为缓冲。DMAP 的 pKa 为 9.5,因此在 pH 9 周围具有良好的缓冲功率,与许多其他缓冲器不同,DMAP 没有发现可以促进 CDAP 水解8。此外,DMAP 已经是一个中间过程,因此不会在反应混合物中添加新的组件。在添加 CDAP 之前对 pH 进行预先调整,消除反应开始时的大 pH 摆动,并允许在反应期间更有效地维护目标 pH 值。第二个改进是在 0 °C 下执行激活反应,CDAP 水解率明显低于室温下。试剂半衰期较长,温度为 0 °C,激活时间从 3 分钟增加到 15 分钟,以补偿低温下的激活速度较慢。反应时间越长,维护反应pH值就越容易。使用 0 °C 还可以减缓 pH 敏感多糖的降解,从而有可能制备此类多糖的结合体。协议的改进使激活过程不那么狂热,更容易控制,更易于重复,更易于扩展。
本文介绍了在 0 °C 和指定目标 pH 值下对多糖进行受控 CDAP 激活以及随后使用 ADH 对激活的多糖进行衍生的改进协议。还描述了一种三硝基苯硫酸(TNBS)检测,基于齐等人的方法,用于确定改性多糖上的水合物水平。还描述了基于氧化醇和硫酸10的六氧化硫的改性检测,可用于确定更广泛的多糖。有关CDAP激活和结合的更多信息,读者被李斯等人提及早期出版物5、6、8。
CDAP 是一种方便的试剂,可衍生和结合多糖。本文描述了使用CDAP用水合物(PS-ADH)衍生多糖的一般方法,并结合了最近发表的改进8。首先,该技术强调保持目标pH值以控制激活过程的重要性。我们发现,虽然许多常见的缓冲器干扰CDAP激活反应,DMAP可以成功地用作缓冲管理pH8。此外,DMAP 已经是 CDAP 激活的副产品。最后,在添加 CDAP 之前,用 DMAP 缓冲多糖溶液有助于精确定位和维护反应 pH 值。正如我们描述的那样,调整集中的 DMAP 库存解决方案的 pH 值是有用的,这样当稀释时,它就会达到目标 pH 值。其次,在寒冷中执行过程减慢了反应时间,使激活过程不那么狂热和宽容。较低的温度降低了 CDAP 水解率,pH 9 的最佳激活时间从 +3 分钟增加到 ±15 分钟。此外,与在室温下执行时相比,实现相同激活水平所需的 CDAP 更少。
ADH衍生的多糖可以与使用碳水化合物(例如EDAC)7的蛋白质结合。例如,几种获得许可 的流感嗜血杆菌 b (Hib) 疫苗使用与 ADH 衍生的多脂乙酰磷酸盐 (PRP) 使用 EDAC 与破伤风毒素结合。CNBr 最初被雇用,但 CDAP 是一种更容易用于此目的的试剂。根据我们的经验,ADH 衍生化的良好目标范围是每 100 kDa 多糖 10-30 水合物或按重量分乘 +1-3% ADH。
同样的过程可以用来用原胺代替ADH来提取多糖与原胺。建议使用六烷二胺将多糖与胺8一起提取。聚糖(PS-NH2)可以使用为蛋白质结合11开发的试剂进行结合。通常,PS-NH2 是用雄胺(例如,磺胺 4-[N-雄性甲基甲基] 环氧烷-1-碳基酸盐 (SMCC) 或 N-γ-马莱米多-氧西尼酰胺酯 (GMBS) 来衍生的,蛋白质是硫化的(例如, 与苏奇尼米尔 3 – (2 – 皮里迪尔迪西奥) 丙酸酯 (SPDP)。硫磺胺化学是非常有效的。
蛋白质也可以通过莱辛酸上的亚胺直接与CDAP激活的多糖耦合。虽然使用的激活协议通常与此处描述的方案相似,但有必要优化活化水平、多糖和蛋白质浓度,以及蛋白质:多糖比 5、6、8。
Dextran 是最容易用 CDAP 激活的多糖之一,因为它的羟基组密度相对较高,但一些多糖,如维抗原,可能具有挑战性。因此,没有单一的”最佳”协议,CDAP直接结合蛋白质。我们建议首先制定一个协议,以达到适当的激活水平,由水合物衍生化程度决定,然后着手将蛋白质结合直接引向CDAP激活的多糖。
The authors have nothing to disclose.
这里描述的工作是由菲娜生物解决方案有限责任公司资助的。
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |