光学镊子研究翻译调控中的RNA-蛋白质相互作用

通过mRNA将遗传信息从DNA传递到蛋白质是一个复杂的生化过程，通过细胞内的大分子相互作用在各个层面上进行精确调节。对于翻译调控，RNA-蛋白相互作用赋予了对各种刺激和信号快速反应的关键作用^1，2。一些RNA-蛋白质相互作用会影响mRNA的稳定性，从而改变RNA翻译活性的时间。其他RNA-蛋白质相互作用与重新编码机制有关，例如停止密码子读通，旁路或程序化核糖体移码（PRF）^{3，4，5，6，7}。最近，许多RNA结合蛋白（RMP）已被证明与刺激性mRNA元件和翻译机制相互作用，以决定何时以及在细胞中发生多少重新编码^{7，8，9，10，11}。因此，为了剖析RNA结合蛋白在翻译中的作用以及它们如何调节RNA结构和稳定性，详细研究这些RNA-蛋白复合物的相互作用原理和力学性质至关重要。

数十年的工作为研究翻译的多步骤和多组分过程奠定了基础，该过程依赖于翻译机器的RNA和蛋白质组分之间的复杂通信来实现速度和准确性^12，13，14。理解复杂调节事件的关键下一步是在高精度平移过程中确定力、时间尺度和结构决定因素^{12，15，16，17}。单分子工具的出现进一步阐明了RNA构象动力学的研究，特别是反式辅助因子在翻译过程中如何作用于RNA结构，这些工具的出现进一步阐明了^{16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26}.

光学镊子（OT）代表了一种高度精确的单分子技术，已被应用于研究多种RNA依赖性动态过程，包括转录和翻译^{26，27，28，29，30，31，32}。光学镊子的使用允许详细探测这些过程的分子相互作用，核酸结构以及热力学性质，动力学和能量学^16，17，^{22，33，34，35，36，37，38，39}.光学镊子测定基于用聚焦激光束捕获微观物体。在典型的OT实验中，感兴趣的分子被拴在两个透明（通常是聚苯乙烯）珠子之间（图1A）²⁷。然后，这些珠子被光学陷阱捕获，其行为类似于弹簧。因此，施加在分子上的力可以基于磁珠从聚焦激光束中心（陷阱中心）的位移来计算。最近，光学镊子与共聚焦显微镜相结合（图1B），可实现荧光或Förster共振能量转移（FRET）测量^40，41，42。这开辟了一个全新的可能实验领域，允许同时测量，从而精确地将力光谱和荧光数据联系起来。

在这里，我们展示了使用光学镊子结合共聚焦显微镜的实验，以研究调节翻译移帧的蛋白质 – RNA相互作用。在物镜和冷凝器之间，具有五个通道的流通池可实现层流连续的样品应用。通过微流体通道，可以直接注射各种组分，这减少了动手时间，并且在整个实验过程中允许非常少的样品消耗。

首先，提出了辅助OT实验设计的基本指南，并讨论了各种设置的优点和缺点。接下来，描述了样品的制备和实验工作流程，并提供了数据分析方案。为了代表一个例子，我们概述了从RNA拉伸实验中获得的结果，以研究SARS-CoV-2移码RNA元件（图2A）， 其反式因子锌指抗病毒蛋白（ZAP）的短同种型改变了病毒RNA从替代阅读框架^的翻译43。此外，还证明荧光标记的核糖体可用于这种OT共聚焦测定，这对于监测翻译机制的处理能力和速度是有用的。这里介绍的方法可用于快速测试不同缓冲液，配体或其他细胞组分的作用，以研究翻译的各个方面。最后，讨论了常见的实验陷阱以及如何排除故障。下面，概述了实验设计中的一些关键点。

施工设计
原则上，有两种常见的方法来创建OT兼容的RNA构建体。第一种方法采用长RNA分子，该分子与互补的DNA手柄杂交，从而产生由两个RNA / DNA杂交区域组成的构建体，中间是单链RNA序列的两侧（图2B）。大多数OT RNA实验都采用了这种方法^33，44，45。

第二种方法利用具有短悬伸（约20 nt）的dsDNA句柄^15，17。然后将这些悬垂与RNA分子杂交。虽然设计上更复杂，但dsDNA手柄的使用克服了DNA/RNA杂交系统的一些局限性。原则上，即使是非常长的手柄（>10kb）也可以实现，这对于共聚焦测量更方便。此外，RNA分子可以连接到DNA手柄上，以提高系留稳定性。

最终标签策略
该结构必须通过强分子相互作用拴附到珠子上。虽然有一些方法可用于手柄与珠子的共价键^合46，但强但非共价的相互作用，如链霉亲和素 – 生物素和地高辛 – 抗体通常用于OT实验^{15，33，35，45}。在所描述的方案中，构建体用生物素或地高丝宁标记，并且珠子分别涂有链霉亲和素或针对地高辛的抗体（图1A）。这种方法适用于施加高达约60 pN（每系绳）^的力47。此外，使用不同的5’和3’标记策略可以确定珠子之间形成的系绳的方向¹⁷。

用于荧光测量的蛋白质标记
对于共聚焦成像，有几种常用的荧光标记方法。例如，荧光团可以共价附着在蛋白质中的氨基酸残基上，或者通过反应性有机基团通过位点导向诱变引入。硫醇或胺反应性染料可分别用于半胱氨酸和赖氨酸残基的标记。有几种可逆的保护方法可以增加标记的特异性^48，49，但是天然蛋白质通常会在多个残基处标记。虽然荧光团的小尺寸可能带来优势，但非特异性标记可能会干扰蛋白质活性，因此信号强度可能会变化⁴⁹。此外，根据标记效率的不同，不同实验之间的信号强度可能会有所不同。因此，应在实验之前执行活动检查。

如果感兴趣的蛋白质含有N端或C端标签，例如His标签或链球菌标签，则这些标签的特定标记代表了另一种流行的方法。此外，标签靶向标记可降低荧光团干扰蛋白质活性的机会，并可提高溶解度⁴⁹。然而，标签特异性标记通常产生单荧光团标记的蛋白质，这可能很难检测。另一种特异性标记方法可以通过使用抗体来完成。

微流体设置
OT与微流体系统的结合允许在不同的实验条件之间快速过渡。此外，电流系统利用了维持流通池内部的层流，这排除了相对于流动方向的垂直方向上来自其他通道的液体的混合。因此，层流对于实验设计特别有利。目前，通常使用多达5个通道的流通池（图3）。