Een gegeneraliseerde methode voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en antioxidantcapaciteit van granen en peulvruchten
Summary
Fenolzuren zijn belangrijke fytochemicaliën die aanwezig zijn in volle granen. Ze bezitten bioactieve eigenschappen zoals antioxiderende beschermende functies. Dit werk was gericht op het rapporteren over een gegeneraliseerde methode voor de HPLC-identificatie, schatting van het totale fenolgehalte en bepaling van de antioxidantcapaciteit van fenolzuren in granen en peulvruchten.
Abstract
Fenolzuren zijn een klasse van organische verbindingen die zowel een fenolgroep als een carbongroep dragen. Ze worden gevonden in granen en concentreren zich in de zemelen van granen of zaadlaag van peulvruchten. Ze bezitten antioxiderende eigenschappen die de afgelopen jaren veel onderzoeksinteresse hebben gegenereerd, over hun potentiële antioxidant beschermende gezondheidsfuncties. Dit werk presenteert een gegeneraliseerde methode voor de extractie van vrij oplosbare fenolzuren uit volle granen en analyse van hun antioxidantcapaciteit. Vijf volkoren monsters bestaande uit twee granen (tarwe en gele maïs) en drie peulvruchten (cowpea bonen, nierboon en sojabonen), werden gebruikt. De korrels werden gemalen tot meel en hun vrij oplosbare fenolzuren werden geëxtraheerd met behulp van waterige methanol. De verbindingen werden vervolgens geïdentificeerd met behulp van een hogedrukvloeistofchromatograaf (HPLC). De Folin-Ciocalteu-methode werd gebruikt om hun totale fenolgehalte te bepalen, terwijl hun antioxidantcapaciteiten werden bepaald met behulp van de DPPH-radical scavenging-capaciteit, Trolox-equivalente antioxidantcapaciteit (TEAC) en zuurstofradicaalabsorptiecapaciteit (ORAC) -testen. De geïdentificeerde fenolzuren omvatten vanilline-, cafeïne-, p-coumarine– en ferulazuren. Vanillic zuur werd alleen geïdentificeerd in cowpea, terwijl cafeïnezuur alleen werd geïdentificeerd in nierbonen. p-coumarinezuur werd geïdentificeerd in gele maïs, cowpea en sojabonen, terwijl ferulazuur in alle monsters werd geïdentificeerd. Ferulazuur was het overheersende fenolzuur dat werd geïdentificeerd. De totale concentratie van fenolzuren in de monsters daalde in de volgende volgorde: sojabonen > cowpea-bonen > gele maïs = nierboon > tarwe. De totale antioxidantcapaciteit (som van de waarden van DPPH-, TEAC- en ORAC-assays) daalde als volgt: sojabonen > nierboon > gele maïs = cowpea-bonen > tarwe. Deze studie concludeerde dat HPLC-analyse en DPPH-, TEAC- en ORAC-assays nuttige informatie bieden over de fenolzuursamenstelling en antioxiderende eigenschappen van volle granen.
Introduction
Fenolzuren behoren tot de belangrijkste fytochemicaliën die in planten worden bestudeerd vanwege de vitale rol die ze spelen bij de verdediging van planten tegen herbivore en schimmelinfecties, evenals het behoud van structurele ondersteuning en integriteit in plantenweefsels 1,2. Ze zijn overvloedig aanwezig in de zemelen van granen en zaadlaag van peulvruchten3. Structureel zijn ze verdeeld in twee groepen: de hydroxybenzoëzuren (figuur 1) en hydroxycinnamic zuren (figuur 2). De veel voorkomende hydroxybenzoëzuren in granen en peulvruchten omvatten galluszuur, p-hydroxybenzoïcum, 2,4-dihydroxybenzoïcum, protocatechuic, vanillic en syringinezuur, terwijl de gemeenschappelijke hydroxycinnaminezuren cafeïnezuur, p-coumarinezuur, ferulazuur en sinapiczuren omvatten3. Fenolzuren bezitten ook antioxiderende eigenschappen omdat ze vrije radicalen kunnen opruimen, die oxidatieve ranzigheid in vetten veroorzaken, en radicaal-geïnduceerde oxidatieve stress in fysiologische systemen initiëren en verspreiden 4,5. Vanwege deze vitale fysiologische rol als antioxidanten, zijn ze het onderwerp van recent onderzoek. Dit komt omdat wanneer ze worden geconsumeerd als componenten van plantaardig voedsel, ze antioxiderende bescherming kunnen uitoefenen.
Granen en graanproducten zijn belangrijke koolhydraatvoedselbronnen voor mens en dier wereldwijd6. Granen omvatten tarwe, rijst, maïs (maïs), gerst, triticale, gierst en sorghum. Onder hen is maïs de meest gebruikte, met een geschat wereldwijd gebruik van 1.135,7 miljoen ton in 2019/2020, gevolgd door tarwe met een geschat wereldwijd gebruik van 757,5 miljoen ton in dezelfde periode7. Graanproducten zijn geweldige energiebronnen voor consumenten, omdat ze rijke bronnen van koolhydraten zijn. Ze bieden ook wat eiwitten, vetten, vezels, vitamines en mineralen6. Naast hun voedingswaarde zijn granen goede bronnen van fytochemische antioxidanten, met name fenolzuren, die het potentieel hebben om het fysiologische systeem te beschermen tegen radicaal-geïnduceerde oxidatieve schade3. Peulvruchten zijn ook goede bronnen van voedingsstoffen en zijn over het algemeen hoger in eiwitten dan granen. Ze bevatten ook vitamines en mineralen en worden gebruikt bij de bereiding van verschillende voedingsmiddelen8. Bovendien zijn peulvruchten goede bronnen van een verscheidenheid aan fytochemische antioxidanten, waaronder fenolzuren, flavonoïden, anthocyanen en proanthocyanidinen 9,10. Verschillende soorten granen en peulvruchten kunnen een verschillende fenolzuursamenstelling hebben. Er is daarom de noodzaak om de fenolzuursamenstelling van granen en peulvruchten en hun variëteiten te bestuderen, om hun potentiële gezondheidsvoordelen met betrekking tot fenolische antioxidanten te kennen.
Een aantal testen zijn gerapporteerd voor het meten van de hoeveelheid fenolzuren in granen en peulvruchten en het bepalen van hun antioxiderende activiteiten. De meest voorkomende analysemethoden voor volkorenfenolzuren zijn spectrofotometrie en vloeistofchromatografie11. Het doel van dit werk was om een gegeneraliseerde hogedruk vloeistofchromatografische methode te demonstreren voor het bepalen van de vrij oplosbare fenolzuursamenstelling en spectrofotometrische methoden voor het bepalen van het totale fenolgehalte en de antioxidantcapaciteit van sommige volkoren granen en peulvruchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volle granen werden geselecteerd als representatieve graankorrels en peulvruchten die wereldwijd brede voedseltoepassingen vinden. Hoewel er variaties kunnen bestaan tussen cultivars van elk graan, was de focus van deze studie om een gegeneraliseerde methode voor vrije fenolzuurextractie en analyse voor volle granen aan te tonen. De extractiemethode werd gewijzigd door de hoeveelheden monsters en oplosmiddelen aanzienlijk te verminderen, om de hoeveelheid chemicaliën die bij dergelijke experimenten in het milieu zoud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van mevrouw Alison Ser en mevrouw Hannah Oduro-Obeng, evenals de ondersteuning voor videobewerking door mevrouw Janice Fajardo en de heer Miguel del Rosario.
Materials
| 15 mL Falcon conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| 2 mL Amber glass ID Surestop vial | Thermo Scientific | C5000-2W | |
| 2 mL Amber microcentrifuge tubes | VWR | 20170-084 | |
| 2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) | Sigma-Aldrich | 440914-100G | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, | Sigma Aldrich | A1888-2G | |
| 2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) | Sigma Aldrich | D913-2 | |
| 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% | Fluka Chemika | 56510 | |
| 9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps | Thermo Scientific | 60180-670 | |
| 96 well flat bottom plates | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Agilent BioTek ELx800 microplate reader | Fisher Scientific | BT-ELX800NB | |
| Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System | Fisher Scientific | N/A | |
| Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader | Fisher Scientific | N/A | |
| Analytical balance SI-114 | Denver Instrument | SI-114.1 | |
| Autosampler, Waters 717 Plus | Waters | WAT078900 | |
| BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip | BD | 309657 | |
| Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 | Millipore Sigma | Z245143 | |
| Corning LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) | Merck Millipore Ltd | HVLP04700 | |
| Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) | Merck Millipore Ltd | HVHP04700 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
| Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL | Eppendorf | 3123000071 | |
| Eppendorf Research plus, 100-1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus, 10-100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| Ethyl acetate, HPLC grade | Fisher Chemical | E195-4 | |
| Ferulic acid standard | Sigma Aldrich | 128708-5G | |
| Fluorescein | Fisher Scientific | AC119245000 | |
| Folin & Ciocalteu phenol reagent | Sigma Aldrich | F9252 | |
| Formic acid, 99% | Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a | 27048-0010 | |
| Gallic acid standard | Sigma | G7384 | |
| High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 | Waters | 960402 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Chemical | A452-4 | |
| Micro pipet tips, 0.5-10 µL | Fisherbrand | 21-197-2F | |
| Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge | Thermo Scientific | 75002435 | |
| Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL | Sartorius | 728240 | |
| Photodiode array detector, Waters 2996 | Waters | 720000350EN | |
| Pipet tips, 1000 µL | VWR | 83007-382 | |
| Pipet tips, 1-5 mL | VWR | 82018-840 | |
| Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% | Sigma Aldrich | 216224-100G | |
| Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom | Corning | 4321-250 | |
| Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ | Thermo Scientific | 17326-103030 | |
| Roto evaporator, IKA RV 10 | IKA | 0010005185 | |
| Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous | Fisher Chemical | S263-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Mallinckrodt AR® | 7581 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) | Fisher bioreagents | BP329-500 | |
| Standardization pipet tips 0-200µL | Fisherbrand | 02-681-134 | |
| Syringe Driven Filter unit (0.22 µm) | Millex®-GV | SLGVR04NL | |
| Target micro-serts vial insert (400 µL) | Thermo Scientific | C4011-631 | |
| Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) | Millipore | ZRQSVP030 |
References
- Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478 (2014).
- Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
- Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
- Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
- Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
- Beverly, R. L., Motarjemi, Y. . Encyclopedia of Food Safety. 3, 309-314 (2014).
- FAO. Food Outlook – Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , (2020).
- Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
- Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
- Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27 (2016).
- Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
- AOAC. . Official Methods of Analysis. 17th edn. , (2000).
- Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158 (2020).
- Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, 307-315 (2016).
- Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
- Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
- Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
- Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
- Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).
