Ces protocoles fournissent la méthodologie utilisée pour évaluer l’activité enzymatique de membres individuels de la famille de la méthyltransférase d’arginine de protéine (PRMT) dans les cellules. Des directives détaillées sur l’évaluation de l’activité de PRMT utilisant des biomarkers endogènes et exogènes, la méthyl-arginine reconnaissant des anticorps, et les composés d’outil d’inhibiteur sont décrites.
Les méthyltransférases protéiques (PRT) catalysent le transfert d’un groupe méthyle vers des résidus d’arginine de protéines de substrat. La famille de PRMT se compose de neuf membres qui peuvent monométhyler ou symétriquement/asymétriquement diméthyler des résidus d’arginine. Plusieurs anticorps reconnaissant différents types de méthylation de l’arginine de diverses protéines sont disponibles; fournissant ainsi des outils pour le développement d’essais de biomarqueurs d’activité PRMT. Les tests basés sur les anticorps PRMT sont difficiles en raison du chevauchement des substrats et des spécificités des anticorps à base de motifs. Ces issues et l’installation expérimentale pour étudier la méthylation d’arginine contribuée par des DIFFÉRENTS PRMTs sont discutées. Grâce à la sélection minutieuse des substrats représentatifs qui sont des biomarqueurs pour huit des neuf PRMT, un panel d’essais d’activité PRMT a été conçu. Ici, les protocoles pour des analyses cellulaires mesurant quantitativement l’activité enzymatique des différents membres de la famille de PRMT dans les cellules sont rapportés. L’avantage des méthodes décrites est leur performance simple dans n’importe quel laboratoire avec des capacités de culture cellulaire et de western blot fluorescent. La spécificité du substrat et la fiabilité des anticorps choisies ont été entièrement validées avec des approches de knockdown et de surexpression. En plus des lignes directrices détaillées sur les biomarqueurs et les anticorps d’essai, des informations sur l’utilisation d’un outil inhibiteur de la collecte de composés pour les PRMF sont également fournies.
La méthylation de l’arginine est une modification post-traductionnelle importante qui régule les interactions protéine-protéine et protéine-ARN, jouant ainsi un rôle important dans divers processus cellulaires tels que l’épissage pré-ARNm, les dommages à l’ADN, la réponse de transcription et la transduction médiée par le facteur de croissance1,2. L’arginine est méthylée par des protéines arginine méthyltransférases (PRT) aboutissant à la monométhyl arginine (Rme1), à ladiméthylarginine asymétrique (Rme2a), ou à la diméthylarginine symétrique (Rme2s)3. Sur la base du type de méthylation, les PRMT sont classés en trois groupes: type I (PRMT1, 2, 3, 4, 6 et 8), qui catalysent la diméthylation mono- et asymétrique; Type II (PRMT5 et PRMT9), qui catalysent la diméthylation mono- et symétrique; et le type III (PRMT7), qui ne peut monométhyler que l’arginine3.
En raison d’un nombre croissant d’anticorps méthylation-spécifiques d’arginine disponibles dans le commerce, l’activité de PRMT peut être mesurée utilisant le buvard occidental. Le transfert western à base fluorescente est la technique préférée à la détection chimiluminescente en raison d’une plage dynamique et d’une linéarité plus grandes, d’une sensibilité plus élevée et d’un multiplexage4. Pour quantifier les niveaux de méthylation des protéines, la normalisation du signal de méthylation aux niveaux totaux de protéines est nécessaire. En choisissant les anticorps pour les protéines totales et méthylées élevées chez différentes espèces hôtes (p. ex. souris et lapin), des anticorps secondaires marqués avec différents fluorophores peuvent être utilisés et le signal pour les deux anticorps peut être déterminé dans la même bande d’échantillon. Des anticorps de méthyl-arginine ont été développés pour identifier et caractériser les protéines monométhylated, asymétriquement, ou symétriquement dimethylated où la méthyl-arginine est trouvée dans un contexte spécifique. Étant donné que la majorité des PRMF méthylate glycine- et les motifs riches en arginine dans leurs substrats5,plusieurs anticorps ont été augmentés pour les peptides contenant des répétitions monométhyliques ou asymétriques et symétriques de diméthyle-arginine-glycine telles que D5A12, ASYM24, ou ASYM25, et SYM11, respectivement. D’autres anticorps de méthyl-arginine ont été générés contre une bibliothèque peptidique contenant de la diméthyle asymétrique et symétrique et de la monométhyl arginine dans un contexte de répétition facilitant la détection de la méthyl-arginine dans ces contextes particuliers6. Il existe également un nombre croissant d’anticorps qui reconnaissent la marque d’arginine spécifique sur une seule protéine qui permettent la détection sélective de la méthylation telle que l’histone H4R3me2a ou BAF155-R1064me2a.
Il existe plusieurs inhibiteurs de la PRMT disponibles dans le commerce, qui peuvent être utilisés comme outils pour les tests cellulaires de la PRMT. Cependant, tous ne sont pas bien caractérisés pour la sélectivité et les effets hors cible et certains doivent être utilisés avec prudence. Le Consortium de génomique structurelle, en collaboration avec des laboratoires universitaires et des partenaires pharmaceutiques, a mis au point des inhibiteurs de la PRMT (sondes chimiques) puissants, sélectifs et perméables aux cellules bien caractérisés qui peuvent être utilisés sans restriction par la communauté scientifique. Des informations sur ces inhibiteurs peuvent être trouvées sur https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics et https://www.chemicalprobes.org/. Les sondes chimiques sont des inhibiteurs de petites molécules avec IC in vitro 50 ou Kd < 100 nM, une sélectivité supérieure à 30 fois sur les protéines de la même famille et une activité cellulaire significative à 1 μM. De plus, chaque sonde chimique a un analogue chimique proche qui est inactif contre la cible prévue7,8,9,10,11,12.
Le but de ce protocole est de mesurer l’activité cellulaire des différents membres de la famille de PRMT utilisant la méthode occidentale fluorescente de tache. Ici, des informations détaillées sur les biomarqueurs d’analyse validés, les anticorps et les inhibiteurs actifs des cellules ainsi que des stratégies précieuses pour une mise en œuvre réussie de l’essai sont fournies.
Ici, les protocoles d’analyse cellulaire détaillés pour les membres de la famille PRMT sont décrits qui utilisent des méthodes de buvard occidental fluorescent. Des substrats uniques pour lesquels les changements de la méthylation d’arginine peuvent être facilement détectés sur la perte individuelle de PRMT ou l’inhibition catalytique et ne peuvent pas être compensés par d’autres membres de la famille ont été choisis. Certaines protéines sont méthylées par plusieurs PRMT21,23,ce qui suggère un chevauchement dans la spécificité du substrat où certains PRMT N’apportent qu’une petite quantité de marque cellulaire dans un substrat protéique donné24,25,26,27,par exemple, PRMT8 et PRMT1 contribuent à la méthylation de l’EWS. Par conséquent, chaque essai nécessitait une validation approfondie des substrats et des anticorps avec des expériences de knockdown et/ou de surexpression et une validation supplémentaire avec des inhibiteurs sélectifs bien caractérisés. Des substrats spécifiques de PRMT ont été identifiés pour lesquels des changements de marque de méthylation pourraient être détectés dans les 2-3 jours de perte/inhibition de POST-PRMT pour éviter des effets de composition de viabilité et de prolifération cellulaire réduites qui peuvent indirectement affecter les niveaux de marque de méthyl-arginine. Bien qu’il ait été possible de trouver des substrats uniques pour PRMT1, 4, 5, 7 et 9; pour PRMT3, 6 et 8, l’approche du gain de fonction a dû être utilisée. Plusieurs anticorps méthyl-spécifiques d’arginine ont été examinés pour de diverses cibles cellulaires, mais aucun n’a pu détecter des changements significatifs dans les 3 jours de prmt3 et de knockdown PRMT6 ; par conséquent, des essais de biomarqueurs ont été développés utilisant des enzymes exprimées ectopiquement ainsi que des mutants catalytiquement inactifs, qui ont servi de contrôle pour la méthylation de substrat de ligne de base. PRMT8 est un homologue PRMT1 proche et partage des préférences de substrat similaires. Comme un biomarqueur sélectif PRMT8 n’a pas pu être identifié, un test dans les cellules knockdown PRMT1 a été développé, où PRMT8 a été co-exprimé avec EWS. PRMT1 est également une enzyme majeure responsable de la méthylation asymétrique H4R3, par conséquent, pour utiliser H4R3me2a comme biomarqueur pour les tests cellulaires PRMT3 et PRMT6, des cellules avec de faibles niveaux basaux de H4R3me2a ont été choisies ainsi que des mutants catalytiquement inactifs ont été utilisés comme contrôle de fond. Bien que les dosages endogènes soient préférés, les dosages exogènes s’avèrent inestimables pour tester la puissance cellulaire de plusieurs inhibiteurs sélectifs de prmt7,8,9. Avec une connaissance croissante de la biologie de la PRMT, nous prévoyons d’améliorer les tests en trouvant des protéines de biomarqueurs plus spécifiques pour PRMT3, PRMT6 et PRMT8.
L’utilisation d’anticorps validés et de contrôles appropriés est essentielle pour la performance de l’essai PRMT. Tous les anticorps recommandés ici ont été soigneusement validés par des expériences de knockdown et de surexpression, cependant, les différences de lot à lot, en particulier dans le cas des anticorps polyclonaux, peuvent encore influencer leurs performances. Par conséquent, il est crucial d’utiliser des méthodes génétiques et des sondes chimiques ainsi que leurs contrôles négatifs étroitement liés pour confirmer la fiabilité de l’analyse. De plus, pour les tests PRMT qui nécessitent une surexpression des protéines, il est crucial d’utiliser des mutants catalytiquement inactifs ainsi que des protéines de type sauvage pour déterminer les niveaux de méthylation basale.
Cette collection d’essais quantitatifs pour le profilage de l’activité des PRMTs dans les cellules peut être largement utile pour la communauté scientifique car elle peut être rapidement et facilement mise en œuvre avec un équipement minimal et une expertise technique limitée, impliquant uniquement des techniques de culture cellulaire de base et de buvardage occidental fluorescent. Les anticorps et les sondes chimiques recommandés pour les PRMF peuvent également être utilisés pour les tests de profilage des protéines basés sur l’activité (ABPP) afin d’établir la pertinence d’une sonde ABPP donnée, de surveiller l’engagement de la cible et d’évaluer les effets hors cible en utilisant le format ABPP compétitif. Les approches de développement d’analyse discutées ici peuvent également être extrapolées pour d’autres familles d’enzymes telles que les protéines lysine-méthyltransférases et les acétyltransférases.
The authors have nothing to disclose.
Le Consortium de génomique structurelle est un organisme de bienfaisance enregistré (no 1097737) qui reçoit des fonds d’AbbVie, bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Génome Canada par l’entremise de l’Institut de génomique de l’Ontario [OGI-196], de l’UE et de l’EFPIA par l’entremise de l’entreprise conjointe Initiative en médicaments novateurs 2 [subvention EUbOPEN 875510], de Janssen, de Merck KGaA (alias EMD au Canada et aux États-Unis), de Pfizer, de Takeda et du Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
anti-GFP | Clontech | 632381 | |
anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
anti-Rme1 | CST | 8015 | |
anti-Rme2a | CST | 13522 | |
anti-Rme2s | CST | 13222 | |
anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
FBS | Wisent | 80150 | |
glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |