هنا، ونحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة، مع نصائح لتوليد xenografts والمبادئ التوجيهية لتحليل سلوك الورم، وفلورية المناعة جبل كامل، وتكميم التصوير الكونفوكوكال.
يتم استخدام يرقات حمار وحشي xenografts على نطاق واسع لأبحاث السرطان لإجراء دراسات حية وفي الوقت الحقيقي للسرطان البشري. إمكانية تصور سريع للاستجابة للعلاجات المضادة للسرطان (العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والبيولوجيات) ، وتولد الأوعية والانبثاث مع قرار خلية واحدة ، يضع نموذج xenograft حمار وحشي كخيار أعلى لتطوير الدراسات قبل السريرية.
يقدم مقايسة يرقات حمار وحشي xenograft العديد من المزايا التجريبية مقارنة بالنماذج الأخرى ، ولكن ربما يكون الأكثر لفتا للنظر هو تقليل حجم الحجم وبالتالي الوقت. يسمح هذا التخفيض في الحجم بتصوير الخلايا المفردة ، واستخدام عدد منخفض نسبيا من الخلايا البشرية (متوافقة مع الخزعات) ، وفحص الأدوية متوسطة وعالية الإنتاجية ، ولكن الأهم من ذلك أنه يمكن من تقليل كبير في وقت الفحص. كل هذه المزايا تجعل من الحمار الوحشي xenograft المقايسة جذابة للغاية لتطبيقات الطب الشخصية في المستقبل.
وقد وضعت العديد من بروتوكولات xenograft حمار وحشي مع تنوع واسع من الأورام البشرية; ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في بروتوكول عام وموحد لتوليد يرقات حمار وحشي بكفاءة. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة، مع نصائح لتوليد xenografts والمبادئ التوجيهية لتحليل سلوك الورم، وفلورية المناعة جبل كامل، وتكميم التصوير الكونفوكوكال.
حمار وحشي (دانيو ريو) هو الظهور ككائن حي نموذج الفقاريات قوية لدراسة التنمية والمرض. حمار وحشي أسهم الوراثية المحفوظة للغاية (~ 70٪ علم الأوهام الوراثية و ~ 84٪ الجينات المرتبطة بالأمراض) والميزات الأساسية مورفولوجية الجهاز مع البشر1,2. هذا الحفظ يسمح باستخدام حمار وحشي لنموذج العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك السرطان3،4.
التعامل مع وصيانة حمار وحشي هو أسهل بكثير وأكثر فعالية من حيث التكلفة من الفئران نظرا لصغر حجمها، والخصوبة عالية على مدار السنة والإخصاب الخارجي3،5. لا تتطلب أجنة حمار وحشي تغذية حية خلال أول 5-7 أيام من حياتها وقد استخدمت كنموذج فعال للتنمية والعدوى والسرطان1و4و6و7. تفقس أجنة حمار وحشي في 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf) وهي سباحة حرة مع تشكيل جميع الأعضاء ، والقلب النابض ونظام الدورة الدموية الوظيفية ، والكبد ، والدماغ ، ونخاع الكلى ، وما إلى ذلك1،3. أيضا ، في هذه المرحلة من التطور فقط المناعة الفطرية هي في اللعب ، والمناعة التكيفية لا تزال تتطور ، مما يسمح بالحرمان الفعال العام للخلايا البشرية دون الحاجة إلى استخدام المسوخ المنافض مناعة7،8. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن ليس كل الخلايا البشرية تغرن على قدمالمساواة 9 وأنه، على سبيل المثال، لخلايا سرطان الدم تبين أن الخلايا الفرجية (العدلات وال الضامة) تحتاج إلى أن تستنفد من أجل الحرمان الفعال10.
تسمح قابلية المسالك الوراثية لسمك الحمار الوحشي والشفافية البصرية في مراحله الجنينية المبكرة بالتصوير داخل الخلية الواحدة بدقة عالية وبالتالي ، لإنشاء أحدث تقنيات التصوير في مجالات متنوعة من البيولوجيا. وعلاوة على ذلك، في سياق السرطان، وهذه الميزات مفيدة للدراسات في الوقت الحقيقي من المراحل الأولى من التفاعلات بين الورم المضيف، مثل دراسة الأوعية والإمكانات النقيلي، فضلا عن التفاعلات مع الجهاز المناعي الفطري8،9،11،12،13.
على الرغم من أن في المقايسة xenograft قصيرة ليس هناك وقت ل “تطور” النقيلي- فمن الممكن لتحليل القدرة النقيلي للخلايا السرطانية (أي كفاءتها للذهاب من خلال خطوات النقيلي مثل الغزو, داخل, البقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية, البذخ, والاستعمار, وبالتالي دراسة هذه العمليات في الجسم الحي وفي الوقت الحقيقي8,11,13,14).
خصائص دورة حياتها وضع حمار وحشي كنموذج فريد للطب الشخصي في السرطان. يمكن إجراء المقايسات في فترة زمنية أقصر والنتائج التي تم الحصول عليها في بضعة أسابيع7،8،9،11،12،15،16. الكرفس وجدوى هذه المقايسات توفر للأطباء والباحثين إمكانية الحصول على نتائج تحويلية يمكن أن تكون مفيدة لمرضى السرطان، الذين الوقت هو حاجة أساسية.
على الرغم من المحاولات المتزايدة لتوليد xenografts جنين حمار وحشي ناجحة، لا تزال هناك حاجة لتوحيد إجراءات الحقن، فضلا عن تقييم صلاحية الخلية وسلوك الورم بعد الحقن.
في هذا البروتوكول نقدم للباحثين دليلا تفصيليا وواضحا خطوة بخطوة لحقن خطوط الخلايا السرطانية البشرية في أجنة حمار وحشي وما يليها من تثبيت ، والتلطخ المناعي ، والتصوير ، وتحديد كمي لسلوك الخلايا السرطانية.
وقد أدى تزايد أهمية الحمار الوحشي كنموذج لتطوير السرطان وفحص الأدوية في العديد من المنشورات3، 4،7،13،14،16،18،19،20،21. ومع ذلك ، فإن حقن الخلايا السرطانية في أجنة حمار وحشي هو تقنية تتطلب مستوى عال من البراعة التي يمكن أن تكون صعبة للباحثين. في هذا البروتوكول ونحن نهدف إلى توفير معلومات عملية وبعض النصائح التي يمكن أن تساعد في التغلب على التحديات الأولية لإنشاء xenografts جنين حمار وحشي.
التعامل مع الخلية الحقن السابقة
هذا البروتوكول الأمثل لتوليد xenografts حمار وحشي مع خطوط الخلية يمكن تكييفها لأنواع مختلفة من الخلايا (السرطانية) مع مورفولوجيا مختلفة. نوصي بأن جميع خطوط الخلية المستخدمة لxenografts حمار وحشي هي الميكوبلازما الحرة. على عكس التلوث البكتيري الأخرى ، فإن وجود الميكوبلازما في زراعة الخلايا لا يولد تغييرات يمكن اكتشافها بسهولة تحت المجهر22. قد يؤثر تلوث الميكوبلازما على إمكانات الحرمان من خطوط الخلايا ، وحساسيتها للأدوية ، وكذلك صلاحية أجنة حمار وحشي.
على الرغم من أن الخلايا قد تستمر في الانتشار لفترة طويلة، إلا أن النمط الظاهري والنمط الجيني يمكن أن يكونا عرضة للتغيرات. من المهم أن تصبح على دراية مورفولوجيا وسلوك خطوط الخلية في الثقافة. نوصي بالحفاظ على عدد مقاطع الخلايا بعد ذوبانها بين 3-12 للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ. وهكذا، ينبغي إجراء اختبارات الميكوبلازما العادية.
يجب أن تكون الخلايا في مرحلة السجل (مرحلة النمو الأسي قبل الوصول إلى التقاء ~ 70٪) في يوم الحقن. وهذا سيمكن من الحرمان الكافي والتطور السليم للسمات المميزة للورم. لمنع الاختلاف في النمط الظاهري للخلايا داخل xenograft، من الأهمية بمكان للحفاظ على التقاء لحقن ثابت بين التجارب. يمكن تكييف عدد الخلايا المحقونة مع خصائص كل خط خلوي لأن بعضها قد يتطلب كثافات أعلى من الحقن من أجل الازدهار في أجنة حمار وحشي.
اعتبارات وضع العلامات على الخلايا
لتصور أفضل للخلايا السرطانية البشرية للحقن والتحليل في المستقبل، يمكن تصنيف الخلايا السرطانية بالأصباغ الفلورية. بسبب الاختلافات في حجم الخلية، يختلف العدد الإجمالي للخلايا/الطول2 في الثقافات الملتصقة بين خطوط الخلايا. وهذا سيؤثر على فعالية بروتوكول تلطيخ وكذلك عدد الخلايا التي تم حصادها للحقن. الخلايا الكبيرة التي تنتج أرقاما منخفضة لكل قارورة (أي Hs578T) أو تنمو في مجموعات (أي BFTC905) سوف تتطلب تجميع عدة قوارير لتجربة واحدة. في هذه الحالة ، لا ينبغي أن يتم تلطيخ الخلايا مباشرة في القارورة لأن هذا سيؤدي إلى استخدام كميات مفرطة من الصبغة (تكلفة عالية). ومن ناحية أخرى، يمكن تلطيخ الخلايا الحساسة للغاية للدورات المفرطة من الطرد المركزي وكذلك تلك التي تنتج أعدادا كبيرة لكل قارورة (أي HCT116) مباشرة في القارورة ثم فصلها بمكشطة EDTA/cell (لمزيد من المعلومات انظر الجدول 1).
كلما كان ذلك ممكنا، بدلا من استخدام نهج الأنزيمية، استخدم EDTA لفصل الخلايا في يوم الحقن، بحيث الخلايا استعادة تقاطعات خلاياها بسرعة أكبر وتتعرض لخطوات أقل الطرد المركزي. ومع ذلك ، إذا كانت الخلايا حساسة لEDTA ، فإنها ملتزمة جدا أو تنمو في مجموعات – يمكن تطبيق طريقة أنزيمية. يعتمد تحسين التركيز المثالي للحقن وكذلك وسيلة الحقن على خصائص كل خط خلية ، وبالتالي قد يحتاج إلى بعض التعديلات(الجدول 1).
معايرة الميكرويجينكشن
على عكس تسليم أوليغونوكليوتيدات أو المخدرات في جنين حمار وحشي، لا يستخدم مساريف لمعايرة الإبرة عند العمل مع خطوط الخلية لxenografts. بعد مرور بعض الوقت أثناء الحقن ، ستبدأ الخلايا في تسد ، ومن الضروري قطع طرف الإبرة لزيادة قطرها أو تغيير الإبرة تماما. هذا الإجراء يعوق معايرة الإكراميات.
لمعالجة هذه المسألة، يتم تنظيم عدد الخلايا التي يتم الاستغناء عنها عن طريق ضغط القذف والوقت اللازم للوصول إلى حجم مماثل لعين الجنين داخل نبضات 1-3. ثم، لمزيد من السيطرة على حجم الورم، في 1 نقطة في البوصة، يتم فرز xenografts وفقا لحجم الورم كما هو مبين في الشكل 6 B-B”. كما هو ممثل في المثال الشكل 6C، هذه الطريقة من الفرز فعالة في الحد من الاختلاف في أحجام الورم: إذا كنا تجمع كل منهم معا (+، ++، +++ ) STEV هو ~ ضعف ++ فئة (~ 906 خلايا إلى ~ 422 خلايا) والاختلاف معامل هو ~ 31.9٪ مقارنة مع 14،5٪ في ++الفئة. منذ المرجع للحقن هو حجم، والعدد الإجمالي للخلايا يختلف كثيرا بين أنواع الخلايا – يجري تعتمد على حجم وشكل الخلايا. على سبيل المثال، تنتج الخلايا الكبيرة التي تحتوي على الكثير من السيتوبلازم مثل سرطان الثدي Hs578T أوراما أصغر بكثير (~ 600 خلية). أيضا، يتطلب كل خط الخلية عدد مختلف من الخلايا. على سبيل المثال، أظهرت خطوط خلايا سرطان المثانة البولية HT29 CRC و RT112 أنه كلما ارتفع عدد الخلايا المحقونة، زادت وفيات سمك الحمار الوحشي. لذلك ، هناك حاجة إلى فترة من التحسين أثناء تطوير xenografts لاختبار ما إذا كان خط الخلية له آثار سامة في الجنين أو يتطلب كثافة أعلى / أقل من الحقن.
موقع الحقن
واحدة من التناقضات الأكثر شيوعا عند توليد xenografts جنين حمار وحشي هو موقع الحقن. صفار عادة ما يكون المكان المفضل للحقن بسبب سهولة الوصول إليها. ومع ذلك ، لاحظنا أن الخلايا التي يتم حقنها في الصفار لديها ميل أعلى للموت. على الرغم من أن من الناحية الفنية أكثر صعوبة، نوصي بحقن في PVS وبقدر الإمكان من القلب. داخل PVS ، يمكن للخلايا تجميع أوعية وخلايا مناعية ، والهجرة ، والاتغلغل ، والبذخ وتشكيل الميكروماتاستاسيس ، إذا كانت تظهر خصائص النقيلي8،11.
كفاءة الحرمان
ومن المتوقع الاختلافات في كفاءة engraftment وحجم الورم بين خطوط الخلايا في 4 نقطة في البوصة بسبب درجاتها المتميزة من موت الخلايا القاعدية / البقاء على قيد الحياة / الانتشار ولكن أيضا بسبب المناعة الفطرية التي قد تظهر كل خط الخلية9.
الانبثاث
يتكون الانبثاث من سلسلة متعددة الخطوات من الأحداث التي يمكن تقسيمها إلى مرحلتين تعسفيتين. في المرحلة الأولى ، يجب على الخلايا السرطانية الانفصال عن الموقع الأساسي ، والهجرة وغزو الأنسجة المجاورة ثم التغلغل في مجرى الدم. في المرحلة الثانية ، يجب أن تبقى الخلايا السرطانية في الدورة الدموية ، وتستعمر من الأوعية الدموية أو اللمفاوية ، وتستعمر في النهاية في المواقع الثانوية23. للتمييز بين هذه الأحداث المبكرة والمتأخرة ومعالجة إمكانات / كفاءة الخلايا السرطانية المختلفة لتنفيذ هذه الخطوات ، قمنا بتصميم فحص بسيط.
بشكل عام ، عند حقنها في PVS ، يمكن للخلايا السرطانية الدخول مباشرة في الدورة الدموية ومن ثم الوقوع في فخ جسديا في الأنسجة الدموية الكاودة (CHT) (منطقة الذيل). ومع ذلك ، وفقا لخصائص كل خلية ورم – رأينا أن بعض الخلايا السرطانية تبقى في CHT 4 نقطة في البوصة وقادرة على تشكيل الأورام الدقيقة في حين تختفي الخلايا السرطانية الأخرى (تطهيرها بعد الوقوع في CHT).
لذلك ، من خلال مقارنة كفاءة الميكروميستاسيس (عند 4 نقطة في البوصة) عندما تم وضع الخلايا مباشرة في الدورة الدموية – CIRC (يجب على الخلايا فقط أن تمر عبر الخطوات المتأخرة من الانبثاث) مقابل متى لا – NO CIRC (تحتاج الخلايا إلى المرور بخطوات مبكرة ومتأخرة لتكون قادرة على تشكيل ميثلاستاس) يمكننا تقييم إمكاناتها النقيلية المبكرة أو المتأخرة. لقد لاحظنا الخلايا السرطانية التي يمكن أن تشكل بكفاءة micrometastasis في CHT في كلتا المجموعتين (CIRC و NO CIRC)، مما يشير إلى أن هذه الخلايا لديها القدرة على الخضوع لجميع خطوات سلسلة النقيلي (SW480 و MDA-MB-468 على سبيل المثال)8،11. في المقابل، الخلايا السرطانية الأخرى لديها إمكانات النقيلي منخفضة جدا في كلتا المجموعتين، بالكاد من أي وقت مضى جعل micrometastasis، حتى عندما حقن في الدورة الدموية (أي مرئية في CHT في 24 hpi، ولكن في 4 نقطة في البوصة أنها لم تعد هناك، Hs578T على سبيل المثال)8. ومع ذلك ، وجدنا بوضوح مجموعة أخرى – واحدة قادرة فقط على تشكيل الميكروكميتاسيس عند حقنها في الدورة الدموية (يمكننا فقط مراقبة الميكروفيتاستاسيس في مجموعة CIRC). وهذا يشير إلى أن هذه الخلايا لديها كفاءة منخفضة في تنفيذ الخطوات الأولى من سلسلة النقيلي ولكن من ناحية أخرى قادرة على البقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، والبذخ واستعمار موقع بعيد.
التلطخ المناعي والتصوير
قبل التثبيت، يمكن استخدام بروتوكول الحقن هذا لأساليب التصوير الحية الأخرى مثل المجهر تباين التداخل التفاضلي الحي (DIC)، المجهر قرص الغزل، التصوير البؤري الحي عالي الدقة والمجهر ورقة الضوء، الخ.
الخلايا الميتة والحطام الخلوي تبدو مشرقة عندما لوحظ من خلال مجسم الفلورسنت ويمكن أن يكون مخطئا للخلايا الحية، وخاصة إذا كان الهدف من الدراسة هو تقييم الإمكانات النقيلي لخطوط الخلية. نود أن نؤكد على أهمية إجراء التصوير الكونف البؤري مع علامات صلاحية محددة وDAPI لتقييم حالة بقاء الورم وmicrometastasis. أيضا، من الضروري استخدام أجسام مضادة بشرية محددة للكشف عن الخلايا البشرية مثل الميتوكوندريا المضادة للإنسان أو HLA المضادة للإنسان. عند تنفيذ البروتوكول ، وتدريب عيون المجرب من خلال مقارنة تلطيخ في مجسم مع الصور confocal. بعد مرور بعض الوقت، يمكن للمجربين التمييز بوضوح بين الحطام والخلايا الحية في المنظار المجسم الفلوري.
على الرغم من أن هناك طرق أخرى لقياس عبء الورم مثل منطقة الفلورسينس بأكملها تستخدم على نطاق واسع ، فإننا نوصي بإجراء بقع مناعة التركيب الكامل والتصوير البؤري كطريقة أكثر دقة. ليس فقط كفاءة تلطيخ صبغة الدهون متغير جدا (أي أن بعض الخلايا ملطخة بشكل جيد للغاية في حين أن البعض الآخر ليس – ربما بسبب محتوى الدهون في أغشيتها) ، ولكن أيضا مرات عديدة تشكل الأصباغ الدهنية مجاميع ، وتميل الخلايا الميتة إلى أن تكون أكثر إشراقا – مما يخلق العديد من القطع الأثرية التي يمكن أن تكون خاطئة للخلايا الحية.
يمكن نقل الخلايا مع البروتينات الفلورية للمساعدة في تتبعها وتخطي وضع العلامات على الخلايا. ومع ذلك، تأكد من أن الخلايا المنقولة وغير المنقولة تنتج نفس النتائج في xenografts حمار وحشي.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الضامة phagocyte هذه الخلايا الفلورية الحطام تصبح وصفت fluorescently والهجرة، وتوليد خلايا النقيلي إيجابية كاذبة. وبالتالي، نوصي بسلسلة من الأدوات التحليلية، والتي بالطبع يمكن توسيعها لتشمل العديد من القراءات الأخرى لتفسير أكثر دقة لسلوك الورم:
للحصول على confocal مع فاصل زمني 5 ميكرومتر بين شرائح في كومة Z من الخلايا السرطانية السيطرة HCT116 (متوسط الحجم النووي من 10-12 ميكرومتر من القطر) مع DAPI counterstaining، لاحظنا أن يتم تقاسم ~ 50٪ من الخلايا بين شريحتين متتاليتين. لذلك، إذا تم حساب كل شريحة، هناك خطر كبير من عد نفس الخلايا مرتين. ذهابا وإيابا بين شرائح لتجنب المشاكل في نتائج القياس الكمي في تقنية تستغرق وقتا طويلا وعرضة للخطأ. لتسهيل القياس الكمي للعدد الإجمالي للخلايا والسماح لمزيد من الاستنساخ بين الباحثين، أنشأنا صيغة حجم الورم الموصوفة سابقا في هذا البروتوكول8.
أدرجنا رقم تصحيح (1.5) لحساب ~ 50٪ الخلايا المشتركة بين شرائح. وجدنا أن متوسط الخطأ في العد اليدوي للورم بأكمله بين الباحثين كان 20٪. اثنين من الباحثين الذين يستخدمون الصيغة كان خطأ 2٪. استخدام هذه الصيغة لديها 93٪ معدل الدقة ومعدل إعادة الإنتاج 98٪. كما اختبرنا الأساليب الآلية، ولكنها أظهرت خطأ أعلى من 50٪ بسبب إعدادات العتبة.
نظرا لخصائص الخلايا المبرمج ، فإن التحديد الكمي لخلايا Caspase 3 المنشطة أكثر صعوبة. لتقليل عدد الأخطاء والتباين في النتائج، نوصي بحساب عينات التحكم والتجريبية من قبل نفس الباحث. بالإضافة إلى ذلك ، عند تعلم هذه التقنية ، يجب على الباحث الجديد عد الصور التي تم قياسها بالفعل من قبل الباحثين الأكثر خبرة لمقارنة النتائج والتدريب.
يمكن تمديد مدة الفحص إذا لزم الأمر. ومع ذلك ، من المهم النظر في أن يرقات حمار وحشي تتطلب تغذية حية بدءا من ~ 7 أيام بعد الإخصاب (5 أيام بعد الحقن). بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف المبادئ التوجيهية واللوائح الخاصة برفاه الحيوان المطبقة على اليرقات التي يزيد عمرها عن 6 أيام بعد الإخصاب.
يوفر هذا البروتوكول أدوات مفيدة لتمكين باحث واحد من حقن ما يقرب من ~ 200-300 يرقة حمار وحشي في الساعة؛ ونتائج الفحص الكامل، بما في ذلك التحليل والتفسير الإحصائي، التي تم الحصول عليها في ثلاثة أسابيع. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على أن يصبحوا خبراء في توليد زنوبرافت سمك الحمار الوحشي. ليس بالأمر السهل؛ بل هو أمر غير سهل. تحتاج إلى ممارسة ولكن سوف تحصل هناك. حظ سعيد!
The authors have nothing to disclose.
نشكر مؤسسة شامباليمود، كونجنتو (LISBOA-01-0145-FEDER-022170، بتمويل مشترك من FCT/Lisboa2020) للتمويل. زمالات FCT لنائب الرئيس (SFRH/BD/118252/2016)، MML (PD/BD/138203/2018). جميع أعضاء مختبر فيور لإجراء مناقشات حاسمة؛ ب. كوستا وسي ريبيلو دي ألميدا لتبادل البيانات؛ وأعضاء مختبرنا C. ريبيلو دي ألميدا، م. باروسو و ل. لييت لمشاركتهم في الفيديو. نود أن نشكر مرفق CF Fish Facility (C. Certal و J. Monteiro وآخرون) وفريق شامباليمود للاتصالات والأحداث والتوعية على وجه الخصوص ألكسندر أزينهيرا على صناعة الأفلام الرائعة وكاتارينا راموس وتيريزا فرنانديز على مساعدتهما.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |