Summary

Производство человеческих CRISPR-инженерных CAR-T-клеток

Published: March 15, 2021
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол редактирования генов в первичных Т-клетках человека с использованием технологии CRISPR Cas для модификации CAR-T-клеток.

Abstract

Приемная клеточная терапия с использованием Т-клеток рецептора химерного антигена (CAR-T-клетки) продемонстрировала замечательную клиническую эффективность у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и в настоящее время исследуется на предмет различных солидных опухолей. CAR-T-клетки генерируются путем удаления Т-клеток из крови пациента и их разработки для экспрессии синтетического иммунного рецептора, который перенаправляет Т-клетки для распознавания и устранения опухолевых клеток-мишеней. Редактирование генов CAR-T-клеток имеет потенциал для повышения безопасности современных CAR-T-клеточных терапий и дальнейшего повышения эффективности CAR-T-клеток. Здесь мы описываем методы активации, расширения и характеристики CD19-направленных CAR-T-клеток человека, спроектированных CRISPR. Это включает в себя трансдукцию лентивирусного вектора CAR и использование однонаправленной РНК (sgRNA) и эндонуклеазы Cas9 для нацеливания генов, представляющих интерес в Т-клетках. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть универсально применены к другим конструкциям CAR и генам-мишеням, помимо тех, которые используются для этого исследования. Кроме того, в этом протоколе обсуждаются стратегии проектирования гРНК, отбора свинцовой гРНК и валидации нокаута генов-мишеней для воспроизводимого достижения высокоэффективной мультиплексной инженерии CRISPR-Cas9 Т-клеток человека клинического класса.

Introduction

Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR)-Т-клетками произвела революцию в области приемной клеточной терапии и иммунотерапии рака. CAR-T-клетки представляют собой инженерные Т-клетки, экспрессирующие синтетический иммунный рецептор, который сочетает антиген-специфический фрагмент одноцепочечного антитела с сигнальными доменами, полученными из цепи TCRzeta, и костимуляторными доменами, необходимыми и достаточными для активации Т-клеток и костимуляции1,2,3,4 . Производство CAR-T-клеток начинается с извлечения собственных Т-клеток пациента, за которыми следует вирусная трансдукция ex vivo модуля CAR и расширение продукта CAR-T-клеток магнитными шариками, которые функционируют как искусственные антиген-презентационные клетки5. Расширенные CAR-T-клетки повторно вводятся пациенту, где они могут приживляться, устранять опухолевые клетки-мишени и даже сохраняться в течение нескольких лет после инфузии6,7,8. Хотя терапия CAR-T-клетками привела к замечательным показателям ответа при злокачественных новообразованиях В-клеток, клинический успех солидных опухолей был поставлен под сомнение несколькими факторами, включая плохую инфильтрацию Т-клеток9,иммуносупрессивную микроокружение опухоли10,охват и специфичность антигена и дисфункцию CAR-T-клеток11,12 . Другое ограничение современной терапии CAR-T-клетками включает использование аутологицных Т-клеток. После нескольких раундов химиотерапии и высокой опухолевой нагрузки CAR-T-клетки могут быть низкого качества по сравнению с аллогенными продуктами CAR-T от здоровых доноров в дополнение ко времени и затратам, связанным с производством аутологичных CAR-T-клеток. Генное редактирование продукта CAR-T-клеток с помощью CRISPR/Cas9 представляет собой новую стратегию преодоления существующих ограничений CAR-T-клеток13,14,15,16,17.

CRISPR/Cas9 представляет собой двухкомпонентную систему, которая может быть использована для целенаправленного редактирования генома в клетках млекопитающих18,19. CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза Cas9 может индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы, управляемые небольшими РНК, путем спаривания оснований с целевой последовательностью ДНК20. При отсутствии шаблона восстановления двухцепочечные разрывы восстанавливаются по подверженному ошибкам пути негомологичных конечных соединений (NHEJ), что приводит к мутациям сдвига кадра или преждевременным стоп-кодонам через мутации вставки и делеции (INDL)19,20,21. Эффективность, простота использования, экономичность и возможность мультиплексного редактирования генома делают CRISPR/Cas9 мощным инструментом для повышения эффективности и безопасности аутологичных и аллогенных CAR-T-клеток. Этот подход также может быть использован для редактирования TCR-направленных Т-клеток путем замены конструкции CAR на TCR. Кроме того, аллогенные CAR-T-клетки, которые имеют ограниченный потенциал вызывать болезнь трансплантата по сравнению с болезнью хозяина, также могут быть сгенерированы путем редактирования генов локуса TCR, b2m и HLA.

В этом протоколе мы показываем, как CRISPR-инженерия Т-клеток может быть объединена с вирусной векторной доставкой CAR-Transgene для генерации отредактированных геномом продуктов CAR-T-клеток с повышенной эффективностью и безопасностью. Принципиальная схема всего процесса показана на рисунке 1. Используя этот подход, мы продемонстрировали высокоэффективный нокаут гена в первичных клетках CAR-T человека. На рисунке 2A подробно описана временная шкала каждого этапа редактирования и изготовления Т-клеток. Также обсуждаются стратегии проектирования направляющей РНК и нокаутной валидации для применения этого подхода к различным генам-мишеням.

Protocol

Человеческие Т-клетки были закуплены через Университет Пенсильвании Human Immunology Core, который работает в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики с установленными стандартными операционными процедурами и / или протоколами для получения, обработки, замораживания и анал?…

Representative Results

Мы описываем здесь протокол генетической инженерии Т-клеток, который может быть использован для генерации как аутологичных, так и аллогенных CAR-T-клеток, а также TCR-перенаправленных Т-клеток. На рисунке 1 приведено подробное описание этапов, участвующих в п…

Discussion

Здесь мы описываем подходы к редактированию генов CAR-T-клеток с использованием технологии CRISPR Cas9 и производству продуктов для дальнейшего тестирования функции и эффективности. Вышеуказанный протокол был оптимизирован для выполнения редактирования генов CRIPSR в первичных Т-клетках чело…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем ядро иммунологии человека для обеспечения нормальных донорских Т-клеток и ядро проточной цитометрии в Университете Пенсильвании.

Materials

4D-Nucleofactor Core Unit Lonza AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit Lonza AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix ThermoFisher 12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody Biolegend 317322 Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1 Biolegend Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers IDT 1075915
CD3/CD28 Dynabeads ThermoFisher 40203D
CD4+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15062
CD8+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle Corning 430768
Corning T150 cell culture flask Millipore Sigma CLS430825
DMSO Millipore Sigma D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504
DynaMag Magnet ThermoFisher 12321D
Glutamax supplement ThermoFisher 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEPES (1 M) ThermoFisher 15630080
huIL-15 PeproTech 200-15
huIL-7 PeproTech 200-07
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup Takara 740609.25
Opti-MEM ThermoFisher 31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L Lonza V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016
pTRPE expression Plasmid in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE CytoArt 200105
RPMI1640 ThermoFisher 12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9 Aldevron 9214
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 326823
Viral packaging mix in house
X-Vivo-15 Media Lonza BE02-060F

References

  1. Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. 癌症研究. 66 (22), 10995-11004 (2006).
  2. Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
  3. Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
  4. Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
  5. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  6. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
  8. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  9. Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
  10. Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
  11. Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
  12. Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
  13. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  14. MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
  15. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  16. Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
  17. Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  19. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  21. Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
  22. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
  23. Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
  24. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  25. Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
  26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).

Play Video

Cite This Article
Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (169), e62299, doi:10.3791/62299 (2021).

View Video