Hemos desarrollado un protocolo simple y económico para cargar complejos de ribonucleoproteína Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) dentro de partículas similares a virus. Estas partículas, llamadas “Nanoblades”, permiten la entrega eficiente del complejo Cas9/sgRNA en células inmortalizadas y primarias, así como in vivo.
El sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)-Cas agrupadas e interespaciadas ha democratizado la edición del genoma en células eucariotas y ha llevado al desarrollo de numerosas aplicaciones innovadoras. Sin embargo, la entrega de la proteína Cas9 y el ARN de guía única (sgRNA) en las células diana puede ser técnicamente un desafío. Los vectores virales clásicos, como los derivados de lentivirus (LV) o virus adenoasociados (AAV), permiten la entrega eficiente de transgenes que codifican para la proteína Cas9 y su sgRNA asociado en muchas células primarias e in vivo. Sin embargo, estos vectores pueden sufrir inconvenientes como la integración del transgén en el genoma de la célula objetivo, una capacidad de carga limitada y la expresión a largo plazo de la proteína Cas9 y el ARN guía en las células objetivo.
Para superar algunos de estos problemas, se desarrolló un vector de entrega basado en el virus de la leucemia murina (MLV) para empaquetar la proteína Cas9 y su ARN guía asociado en ausencia de cualquier transgén codificante. Al fusionar la proteína Cas9 con el extremo C de la proteína estructural Gag de MLV, se formaron partículas similares a virus (VLP) cargadas con la proteína Cas9 y sgRNA (llamadas “Nanoblades”). Las nanocuchillas se pueden recolectar del medio de cultivo de las células productoras, purificarse, cuantificarse y usarse para transducir células diana y entregar el complejo activo Cas9 / sgRNA. Las nanocuchillas entregan su carga de ribonucleoproteína (RNP) de forma transitoria y rápida en una amplia gama de células primarias e inmortalizadas y pueden programarse para otras aplicaciones, como la activación transcripcional transitoria de genes dirigidos, utilizando proteínas Cas9 modificadas. Las nanocuchillas son capaces de editar el genoma in vivo en el hígado de ratones adultos inyectados y en ovocitos para generar animales transgénicos. Finalmente, se pueden complejar con ADN del donante para una reparación dirigida por homología “libre de transfección”. La preparación de Nanoblade es simple, relativamente de bajo costo y se puede llevar a cabo fácilmente en cualquier laboratorio de biología celular.
En comparación con otras nucleasas programables, el sistema CRISPR-Cas simplificó y democratizó drásticamente el procedimiento de orientación y escisión del genoma específico de la secuencia en las células eucariotas. A través de la simple expresión de un sgRNA, los usuarios pueden programar la proteína Cas9 (o variantes optimizadas) para casi cualquier locus celular1. En este escenario, la entrega de la proteína Cas9 y sgRNA se convierte en la principal limitación al realizar la mutagénesis dirigida al sitio. En las células inmortalizadas, el sgRNA y la proteína Cas se pueden expresar fácilmente a partir de plásmidos transfectados para lograr una orientación genómica eficiente en la mayoría de las células. Sin embargo, la expresión constitutiva del complejo Cas9/sgRNA puede aumentar la actividad fuera del objetivo de la proteína Cas9 e introducir cambios no deseados en loci2 no específicos. En las células primarias, la transfección del ADN puede ser técnicamente difícil de lograr y conducir a una mala expresión o a un pequeño porcentaje de células transfectadas. Las alternativas a la transfección clásica de ADN comprenden el uso de vectores virales que entregan un transgén que codifica para cas9 y sgRNA o la electroporación de la proteína Cas9 recombinante acoplada a un sgRNA sintético. Sin embargo, estos enfoques pueden conducir a la integración transgénica dentro del genoma del huésped celular (como es el caso de los vectores clásicos de expresión retroviral y lentiviral), la restricción por factores celulares y conducir a la expresión constitutiva de la proteína Cas9 y sgRNA.
La electroporación del complejo Cas9/sgRNA RNP puede superar la mayoría de estos problemas y conducir a una administración eficiente y transitoria en células primarias e in vivo, así como permitir una respuesta dependiente de la dosis. Sin embargo, generalmente se basa en equipos y reactivos costosos y también es difícil de mejorar si se tiene que tratar una gran cantidad de células. Como alternativa a las técnicas mencionadas anteriormente, estos autores han desarrollado “Nanoblades”, un vector de administración retroviral para la proteína Cas9 y sgRNA3 que es conceptualmente similar a otros sistemas de entrega de proteínas de cápside derivadas de virus4,5,6,7,8. Las nanocuchillas explotan la capacidad natural de la poliproteína Gag de los retrovirus para producir, cuando se expresan solas en células cultivadas, VLP que se liberan en el medio extracelular9. Al fusionar la proteína Cas9 con el extremo C-terminal de la poliproteína Gag del virus de la leucemia murina (MLV) y coexpresar el sgRNA y las glicoproteínas de la envoltura viral, la proteína Cas9 puede encapsidarse dentro de las VLP o Nanoblades liberadas. Tras la purificación, las Nanoblades pueden incubarse con células diana o inyectarse in vivo para mediar en la administración rápida, transitoria y dependiente de la dosis del complejo Cas9/sgRNA RNP3.
Las nanoblades se pueden programar con múltiples sgRNAs para la edición simultánea en diferentes loci o con variantes Cas9 para realizar otras aplicaciones como la activación transcripcional específica del objetivo o la represión3. A diferencia de la electroporación de proteínas, que se basa en la expresión recombinante, las variantes cas recientemente descritas de la literatura se pueden clonar fácilmente en el vector de expresión de fusión Gag, lo que lo convierte en una plataforma versátil. Las nanocuchillas se pueden complejar o cargar con oligodesoxinucleótidos simples y de doble cadena (ssODN) para realizar la reparación dirigida a la homología3. La producción de nanoblade es relativamente simple y barata. Además, las Nanoblades se pueden almacenar a 4 °C durante muchos días o a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Por lo general, las nanocuchillas median la edición eficiente del genoma libre de transgenes en la mayoría de las células inmortalizadas y cultivadas primariamente. Sin embargo, algunas células primarias pueden ser sensibles a la presencia de partículas virales, lo que resulta en un aumento de la mortalidad. Las células del sistema inmune innato también pueden reaccionar a la presencia de Nanoblades (debido a su origen viral) y activarse. En estos casos, el protocolo de transducción debe optimizarse para limitar el tiempo de exposición a Nanoblades y minimizar los efectos inespecíficos. Las nanoblades representan una alternativa viable y fácil de implementar a otros métodos de entrega CRISPR disponibles.
Las nanocuchillas permiten la administración rápida y dependiente de la dosis del complejo Cas9/sgRNA RNP en líneas celulares y células primarias. A diferencia de la transfección clásica y otros vectores de entrega viral, pero al igual que la electroporación de proteínas, las Nanoblades tienen la ventaja de la entrega transitoria del RNP Cas9 / sgRNA de una manera libre de transgenes. Las nanoblades ofrecen una plataforma altamente versátil, simple y económica para la entrega de proteínas que se puede adaptar fácil y rápidamente a la familia en constante expansión de variantes CRISPR. Las nanoblades se pueden producir en la línea celular HEK293T o sus derivados. Las líneas celulares HEK293T utilizadas aquí se han desarrollado para maximizar la producción de partículas retrovirales y lentivirales (consulte la Tabla de materiales). Sin embargo, aunque otras fuentes de células HEK293T pueden ser adecuadas, los usuarios deben probar y comparar células HEK293T de diferentes fuentes, ya que se han observado diferencias importantes en la producción de partículas dependiendo de la fuente de células HEK293T. Las células también deben ser revisadas para detectar contaminación por Mycoplasma con frecuencia y pasar cada tres días (clásicamente dilución de 1/8) para evitar la sobreconfluencia, lo que tiene un impacto negativo en la producción de partículas.
Las células no deben mantenerse durante más de 20 pasajes. Se utilizó DMEM suplementado con glucosa, penicilina/estreptomicina, glutamina y suero bovino fetal descomplementado al 10% para el cultivo celular. Como el origen del suero puede afectar la calidad de la preparación de Nanoblade, se deben probar diferentes lotes de suero antes de la producción a gran escala. Las nanoblades se pueden producir de manera eficiente en otros medios como RPMI o modificaciones sin suero del medio esencial mínimo que pueden reemplazar a DMEM el día después de la transfección. Como se indica a continuación, aunque el reemplazo medio después de la transfección con algunos reactivos de transfección de ADN es opcional, puede ser beneficioso modificar el medio en el que se liberan las VLP, especialmente para limitar los rastros séricos en la preparación de partículas. Sin embargo, el cultivo de células en un medio esencial mínimo de suero reducido el día antes de la transfección aún no se ha intentado.
Como se mencionó, las nanocuchillas se producen tras la sobreexpresión de una mezcla de plásmidos en las células productoras. La sobreexpresión parece ser necesaria para una producción óptima. De hecho, este laboratorio desarrolló una línea celular productora donde la construcción que expresa Gag-Pol se estabilizó mediante la selección de antibióticos; sin embargo, este sistema no pudo producir cantidades significativas de Nanoblades. Una observación similar se hizo cuando la construcción codificante de sgRNA se integró de manera estable en el genoma de las células productoras. Como se describe para otros sistemas de producción de partículas, una línea celular estable que exprese al menos algunas construcciones involucradas en la producción de Nanoblades puede ser útil; sin embargo, esto ciertamente requeriría el procesamiento de grandes volúmenes de sobrenadante y una técnica apropiada para purificar partículas. El protocolo anterior describe el procedimiento preferido para producir Nanoblades que explota reactivos de transfección específicos (consulte la Tabla de materiales).
Aunque los reactivos de transfección de otros fabricantes también se han probado con éxito, la gran mayoría de los resultados de este grupo con Nanoblades siguen el procedimiento descrito en este documento. La transfección de bajo costo se puede lograr utilizando reactivos de fosfato de calcio y producir una buena eficiencia de producción; sin embargo, este método requiere absolutamente el reemplazo del medio de transfección el día después de la transfección y puede dejar residuos de fosfato de calcio en la preparación de partículas sedimentadas. Consistente con la necesidad de altos niveles de expresión para los componentes de Nanoblade dentro de las células productoras es la observación de que la cantidad de sgRNAs asociados con la proteína Cas9 puede ser un factor limitante para la edición eficiente del genoma. Para mejorar la carga de sgRNA, dos enfoques técnicos han sido desarrollados recientemente por grupos independientes que utilizan vectores de entrega de proteínas similares a nanoblades. Estos se basan en el uso de la expresión citoplasmática dependiente de la polimerasa T7 de sgRNA6 o mediante la adición de una señal de encapsidación retroviral a la secuencia de sgRNA para mediar la unión a la poliproteína Gag6. Estos enfoques podrían mejorar la carga de sgRNA dentro de Nanoblades, aunque aún no se han probado.
La transducción de células diana es un paso crítico en el procedimiento. En la mayoría de las líneas celulares inmortalizadas, la transducción con Nanoblades tiene poco o ningún efecto citopático. Sin embargo, en las células primarias, la toxicidad puede ser un problema. Por lo tanto, la transducción debe optimizarse para cada tipo de célula. En concreto, el tiempo de exposición a nanoblades es un factor importante a modificar a la hora de optimizar el protocolo de transducción. Para células sensibles como neuronas primarias o células de la médula ósea, 4-6 h de incubación con Nanoblades antes de reemplazar el medio permiten una entrega eficiente de la proteína Cas9 al tiempo que minimizan la toxicidad celular. Además, los adyuvantes como los polímeros catiónicos, entre otros, pueden mejorar significativamente la eficiencia de la transducción en algunas células (ver la Tabla de Materiales). Es importante tener en cuenta que las Nanoblades son VLP y pueden inducir una respuesta inmunogénica. Esto puede ser una limitación si se trabaja con ciertos tipos de células primarias, como macrófagos o células dendríticas, en las que la incubación con Nanoblades podría inducir cambios importantes en la expresión génica y el fenotipo de las células. Si los macrófagos y las células dendríticas se derivan de precursores de células madre hematopoyéticas (como las células de médula ósea de ratón), es preferible transducir células con las Nanoblades antes de que estén completamente diferenciadas para evitar inducir una respuesta celular contra las Nanoblades. De lo contrario, la electroporación de la proteína Cas9 podría representar una alternativa viable cuando se trabaja con células inmunes diferenciadas.
Las nanocuchillas se pueden utilizar in vivo para transducir cigotos o embriones de ratón para generar animales transgénicos. Al igual que los vectores retrovirales o lentivirales clásicos, también se pueden inyectar directamente en los tejidos de animales adultos. Sin embargo, las nanocuchillas (similares a los vectores retrovirales y lentivirales) pueden ser inactivadas por la respuesta inmune del animal huésped; por lo tanto, la dosis a inyectar debe optimizarse para cada aplicación. Esta respuesta inmune también puede limitar la distribución de VLP funcionales a los tejidos cercanos al sitio de inyección. Finalmente, a diferencia de los vectores lentivirales, las Nanoblades están libres de transgenes y entregan el Cas9 en un marco de tiempo restringido. Por lo tanto, no se pueden utilizar para realizar exámenes funcionales de todo el genoma que requieren una secuenciación de alto rendimiento de sgRNAs tras la selección de células. Las nanocuchillas son útiles cuando se requiere una edición del genoma rápida, dependiente de la dosis y libre de transgenes20. Además, al igual que la electroporación de proteínas, las Nanoblades producen menos efectos fuera del objetivo que la expresión prolongada de Cas9/sgRNA a través de la transfección de ADN o vectores virales clásicos3. El desarrollo futuro de Nanoblades se centra en la incorporación de variantes cas9 para diferentes aplicaciones tecnológicas como la edición de bases y la orientación de ARN.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) de la Universidad de Lyon, dentro del programa Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) operado por la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) y por el Consejo Europeo de Investigación (ERC-StG-LS6-805500 a E.P.R.) en el marco de los programas de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |