Nous avons développé un protocole simple et peu coûteux pour charger des complexes ribonucléoprotéiques Cas9/SINGLE-GUIDE ARN (sgRNA) dans des particules de type virus. Ces particules, appelées « Nanolames », permettent une livraison efficace du complexe Cas9/sgRNA dans les cellules immortalisées et primaires ainsi qu’in vivo.
Le système CRISPR (Short Palindromic Repeats) -Cas (Regular Interspaced) a démocratisé l’édition du génome dans les cellules eucaryotes et a conduit au développement de nombreuses applications innovantes. Cependant, l’administration de la protéine Cas9 et de l’ARN monoguide (ARNg) dans les cellules cibles peut être techniquement difficile. Les vecteurs viraux classiques, tels que ceux dérivés de lentivirus (LV) ou de virus adéno-associés (AAV), permettent une livraison efficace de transgènes codant pour la protéine Cas9 et son ARNg associé dans de nombreuses cellules primaires et in vivo. Néanmoins, ces vecteurs peuvent souffrir d’inconvénients tels que l’intégration du transgène dans le génome de la cellule cible, une capacité de chargement limitée et l’expression à long terme de la protéine Cas9 et de l’ARN guide dans les cellules cibles.
Pour surmonter certains de ces problèmes, un vecteur d’administration basé sur le virus de la leucémie murine (MLV) a été développé pour emballer la protéine Cas9 et son ARN guide associé en l’absence de tout transgène codant. En fusionnant la protéine Cas9 à la terminaison C de la protéine structurelle Gag de MLV, des particules virales (VLP) chargées de la protéine Cas9 et de l’ARNng (appelées « Nanolames ») ont été formées. Les nanolames peuvent être collectées dans le milieu de culture des cellules productrices, purifiées, quantifiées et utilisées pour transduire les cellules cibles et délivrer le complexe Actif Cas9/SGRNA. Les nanolames délivrent leur cargaison de ribonucléoprotéines (RNP) de manière transitoire et rapide dans un large éventail de cellules primaires et immortalisées et peuvent être programmées pour d’autres applications, telles que l’activation transcriptionnelle transitoire de gènes ciblés, à l’aide de protéines Cas9 modifiées. Les nanolames sont capables d’éditer in vivo le génome dans le foie de souris adultes injectées et dans les ovocytes pour générer des animaux transgéniques. Enfin, ils peuvent être complexés avec de l’ADN de donneur pour une réparation dirigée par homologie « sans transfection ». La préparation de Nanoblade est simple, relativement peu coûteuse et peut être facilement effectuée dans n’importe quel laboratoire de biologie cellulaire.
Comparé à d’autres nucléases programmables, le système CRISPR-Cas a considérablement simplifié et démocratisé la procédure de ciblage et de clivage du génome spécifique à la séquence dans les cellules eucaryotes. Grâce à la simple expression d’un ARNg, les utilisateurs peuvent programmer la protéine Cas9 (ou des variantes optimisées) pour presque tous les locus cellulaires1. Dans ce scénario, l’administration de la protéine Cas9 et de l’ARNg devient la principale limitation lors de la mutagénèse dirigée par le site. Dans les cellules immortalisées, l’ARNg et la protéine Cas peuvent être facilement exprimés à partir de plasmides transfectés pour atteindre un ciblage efficace du génome dans la plupart des cellules. Cependant, l’expression constitutive du complexe Cas9/sgRNA peut augmenter l’activité hors cible de la protéine Cas9 et introduire des changements indésirables dans les loci2 non spécifiques. Dans les cellules primaires, la transfection de l’ADN peut être techniquement difficile à réaliser et conduire à une mauvaise expression ou à un faible pourcentage de cellules transfectées. Les alternatives à la transfection classique de l’ADN comprennent l’utilisation de vecteurs viraux qui délivrent un transgène codant pour le Cas9 et l’ARNg ou l’électroporation de la protéine Cas9 recombinante couplée à un ARNg synthétique. Cependant, ces approches peuvent conduire à l’intégration transgénique dans le génome de l’hôte cellulaire (comme c’est le cas pour les vecteurs d’expression rétroviraux et lentiviraux classiques), à la restriction par des facteurs cellulaires et à l’expression constitutive de la protéine Cas9 et de l’ARNg.
L’électroporation du complexe Cas9/sgRNA RNP peut surmonter la plupart de ces problèmes et conduire à une administration efficace et transitoire dans les cellules primaires et in vivo ainsi que permettre une réponse dose-dépendante. Néanmoins, il repose généralement sur des équipements et des réactifs coûteux et est également difficile à mettre à l’échelle si un grand nombre de cellules doivent être traitées. Comme alternative aux techniques mentionnées ci-dessus, ces auteurs ont développé des « Nanoblades » – un vecteur d’administration rétrovirale pour la protéine Cas9 et sgRNA3 qui est conceptuellement similaire à d’autres systèmes d’administration de protéines de capside dérivées du virus4,5,6,7,8. Les nanolames exploitent la capacité naturelle de la polyprotéine Gag des rétrovirus à produire, lorsqu’elles sont exprimées seules dans des cellules cultivées, des VLP qui sont libérés dans le milieu extracellulaire9. En fusionnant la protéine Cas9 à l’extrémité C-terminale de la polyprotéine Gag du virus de la leucémie murine (MLV) et en co-exprimant l’ARNs sg et les glycoprotéines de l’enveloppe virale, la protéine Cas9 peut être encapsidée dans des VLP ou des nanolames libérés. Lors de la purification, les Nanoblades peuvent être incubées avec des cellules cibles ou injectées in vivo pour assurer l’administration rapide, transitoire et dose-dépendante du complexe Cas9/sgRNA RNP3.
Les nanolames peuvent être programmées avec plusieurs sgRNA pour une édition simultanée à différents loci ou avec des variantes Cas9 pour effectuer d’autres applications telles que l’activation ou la répression transcriptionnelle spécifique à la cible3. Contrairement à l’électroporation des protéines, qui repose sur l’expression recombinante, les variantes Cas nouvellement décrites dans la littérature peuvent être facilement clonées dans le vecteur d’expression de fusion Gag, ce qui en fait une plate-forme polyvalente. Les nanolames peuvent être complexées ou chargées d’oligodésoxynucléotides simple brin et double brin (ssODN) pour effectuer une réparation dirigée par homologie3. La production de Nanoblade est relativement simple et bon marché. De plus, les Nanoblades peuvent être stockées à 4 °C pendant plusieurs jours ou à -80 °C pour un stockage à long terme. En règle générale, les Nanoblades interviennent dans l’édition efficace et sans transgène du génome dans la plupart des cellules immortalisées et de culture primaire. Cependant, certaines cellules primaires peuvent être sensibles à la présence de particules virales, ce qui entraîne une augmentation de la mortalité. Les cellules du système immunitaire inné peuvent également réagir à la présence de Nanolames (en raison de leur origine virale) et s’activer. Dans ces cas, le protocole de transduction doit être optimisé pour limiter le temps d’exposition aux Nanoblades et minimiser les effets non spécifiques. Les nanolames représentent une alternative viable et facile à mettre en œuvre aux autres méthodes d’administration CRISPR disponibles.
Les nanolames permettent une administration rapide et dose-dépendante du complexe Cas9/sgRNA RNP dans les lignées cellulaires et les cellules primaires. Contrairement à la transfection classique et à d’autres vecteurs d’administration virale, mais comme l’électroporation des protéines, les nanolames ont l’avantage d’administrer transitoirement le RNP Cas9 / sgRNA d’une manière sans transgène. Les nanolames offrent une plate-forme très polyvalente, simple et peu coûteuse pour l’administration de protéines qui peut être facilement et rapidement adaptée à la famille sans cesse croissante de variantes CRISPR. Les nanolames peuvent être produites dans la lignée cellulaire HEK293T ou ses dérivés. Les lignées cellulaires HEK293T utilisées ici ont été développées pour maximiser la production de particules rétrovirales et lentivirales (voir le Tableau des matériaux). Cependant, bien que d’autres sources de cellules HEK293T puissent convenir, les utilisateurs doivent tester et comparer les cellules HEK293T de différentes sources, car des différences majeures dans la production de particules ont été observées en fonction de la source cellulaire HEK293T. Les cellules doivent également être vérifiées fréquemment pour la contamination par les mycoplasmes et passées tous les trois jours (dilution classique 1/8) pour éviter la surconfluence, qui a un impact négatif sur la production de particules.
Les cellules ne doivent pas être maintenues pendant plus de 20 passages. Le DMEM complété par du glucose, de la pénicilline/streptomycine, de la glutamine et du sérum bovin fœtal décompilé à 10 % a été utilisé pour la culture cellulaire. Comme l’origine du sérum peut affecter la qualité de la préparation Nanoblade, différents lots de sérum doivent être testés avant la production à grande échelle. Les nanolames peuvent être produites efficacement dans d’autres milieux tels que le RPMI ou des modifications sans sérum d’un milieu essentiel minimum qui peuvent remplacer le DMEM le lendemain de la transfection. Comme indiqué ci-dessous, bien que le remplacement du milieu après la transfection par certains réactifs de transfection d’ADN soit facultatif, il peut être avantageux de modifier le milieu dans lequel les VLP sont libérés, en particulier pour limiter les traces sériques dans la préparation des particules. Cependant, la culture de cellules dans un milieu essentiel minimum sérique réduit la veille de la transfection n’a pas encore été tentée.
Comme mentionné, les nanolames sont produites lors de la surexpression d’un mélange de plasmides dans les cellules productrices. La surexpression semble être nécessaire pour une production optimale. En effet, ce laboratoire a développé une lignée cellulaire productrice où la construction exprimant Gag-Pol a été stabilisée par sélection d’antibiotiques ; cependant, ce système n’a pas réussi à produire des quantités importantes de Nanoblades. Une observation similaire a été faite lorsque la construction codant pour l’ARNg a été intégrée de manière stable dans le génome des cellules productrices. Comme décrit pour d’autres systèmes de production de particules, une lignée cellulaire stable exprimant au moins certaines constructions impliquées dans la production de Nanoblades peut être utile; cependant, cela nécessiterait certainement le traitement de grands volumes de surnageant et une technique appropriée pour purifier les particules. Le protocole ci-dessus décrit la procédure préférée pour produire des Nanolames qui exploitent des réactifs de transfection spécifiques (voir la Table des matériaux).
Bien que les réactifs de transfection d’autres fabricants aient également été testés avec succès, la grande majorité des résultats de ce groupe avec Nanoblades suivent la procédure décrite ici. Une transfection à faible coût peut être réalisée à l’aide de réactifs au phosphate de calcium et produire une bonne efficacité de production; cependant, cette méthode nécessite absolument le remplacement du milieu de transfection le lendemain de la transfection et peut laisser des résidus de phosphate de calcium dans la préparation de particules sédimentées. Conformément à la nécessité de niveaux d’expression élevés pour les composants nanolames dans les cellules productrices, on observe que la quantité d’ARNg associés à la protéine Cas9 peut être un facteur limitant pour une édition efficace du génome. Pour améliorer la charge en SGRNA, deux approches techniques ont été récemment développées par des groupes indépendants utilisant des vecteurs d’administration de protéines similaires aux Nanoblades. Ceux-ci reposent sur l’utilisation de l’expression cytoplasmique dépendante de la polymérase T7 de sgRNA6 ou par l’ajout d’un signal d’encapsidation rétrovirale à la séquence d’ARNg pour arbitrer la liaison à la polyprotéine Gag6. Ces approches pourraient en effet améliorer la charge d’ARNg dans les Nanoblades bien qu’elles n’aient pas encore été testées.
La transduction des cellules cibles est une étape critique de la procédure. Dans la plupart des lignées cellulaires immortalisées, la transduction avec Nanoblades a peu ou pas d’effet cytopathique. Cependant, dans les cellules primaires, la toxicité peut être un problème. La transduction doit donc être optimisée pour chaque type de cellule. Plus précisément, le temps d’exposition aux Nanoblades est un facteur important à modifier lors de l’optimisation du protocole de transduction. Pour les cellules sensibles telles que les neurones primaires ou les cellules de la moelle osseuse, 4 à 6 h d’incubation avec des Nanoblades avant de remplacer le milieu permettent une livraison efficace de la protéine Cas9 tout en minimisant la toxicité cellulaire. En outre, les adjuvants tels que les polymères cationiques, entre autres, peuvent améliorer considérablement l’efficacité de la transduction dans certaines cellules (voir la Table des matériaux). Il est important de noter que les Nanoblades sont des VLP et peuvent induire une réponse immunogène. Cela peut être une limitation si vous travaillez avec certains types de cellules primaires, telles que les macrophages ou les cellules dendritiques, dans lesquelles l’incubation avec des nanolames pourrait induire des changements importants dans l’expression des gènes et le phénotype des cellules. Si les macrophages et les cellules dendritiques sont dérivés de précurseurs de cellules souches hématopoïétiques (comme les cellules de moelle osseuse de souris), il est préférable de transduire les cellules avec les Nanolames avant qu’elles ne soient complètement différenciées pour éviter d’induire une réponse cellulaire contre les Nanolames. Sinon, l’électroporation de la protéine Cas9 pourrait représenter une alternative viable lorsque l’on travaille avec des cellules immunitaires différenciées.
Les nanolames peuvent être utilisées in vivo pour transduire des zygotes de souris ou des embryons afin de générer des animaux transgéniques. Semblables aux vecteurs rétroviraux ou lentiviraux classiques, ils peuvent également être injectés directement dans les tissus d’animaux adultes. Cependant, les nanolames (similaires aux vecteurs rétroviraux et lentiviraux) peuvent être inactivées par la réponse immunitaire de l’animal hôte; par conséquent, la dose à injecter doit être optimisée pour chaque application. Cette réponse immunitaire peut également limiter la distribution des VLP fonctionnels aux tissus proches du site d’injection. Enfin, contrairement aux vecteurs lentiviraux, les Nanoblades sont sans transgène et délivrent le Cas9 dans un délai restreint. Par conséquent, ils ne peuvent pas être utilisés pour effectuer des criblages fonctionnels à l’échelle du génome qui nécessitent un séquençage à haut débit des sgRNA lors de la sélection des cellules. Les nanolames sont utiles lorsqu’une édition rapide, dose-dépendante et sans transgène du génome est requise20. De plus, à l’instar de l’électroporation des protéines, les nanolames entraînent moins d’effets hors cible que l’expression prolongée de Cas9/sgRNA par transfection d’ADN ou vecteurs viraux classiques3. Le développement futur de Nanoblades est axé sur l’intégration de variantes Cas9 pour différentes applications technologiques telles que l’édition de base et le ciblage de l’ARN.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été financés par Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) de l’Université de Lyon, dans le cadre du programme Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) géré par l’Agence nationale Français de la recherche (ANR), la Fondation FINOVI, l’Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) et par le Conseil européen de la recherche (ERC-StG-LS6-805500 à E.P.R.) dans le cadre des programmes de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |