Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed economico per caricare complessi di ribonucleoproteine Cas9/single-guide RNA (sgRNA) all’interno di particelle simili a virus. Queste particelle, chiamate “Nanoblades”, consentono una consegna efficiente del complesso Cas9/sgRNA in cellule immortalizzate e primarie e in vivo.
Il sistema CRISPR(Cas) a brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate ha democratizzato l’editing del genoma nelle cellule eucariotiche e ha portato allo sviluppo di numerose applicazioni innovative. Tuttavia, la consegna della proteina Cas9 e dell’RNA a guida singola (sgRNA) nelle cellule bersaglio può essere tecnicamente impegnativa. I vettori virali classici, come quelli derivati da lentivirus (LV) o virus adeno-associati (AAV), consentono una consegna efficiente di transgeni che codificano per la proteina Cas9 e il suo sgRNA associato in molte cellule primarie e in vivo. Tuttavia, questi vettori possono soffrire di inconvenienti come l’integrazione del transgene nel genoma della cellula bersaglio, una capacità di carico limitata e l’espressione a lungo termine della proteina Cas9 e dell’RNA guida nelle cellule bersaglio.
Per superare alcuni di questi problemi, è stato sviluppato un vettore di consegna basato sul virus murino della leucemia (MLV) per confezionare la proteina Cas9 e il suo RNA guida associato in assenza di qualsiasi transgene codificante. Fondendo la proteina Cas9 al C-terminus della proteina strutturale Gag da MLV, si sono formate particelle simili a virus (VLP) caricate con la proteina Cas9 e sgRNA (denominate “Nanoblades”). Le nanolame possono essere raccolte dal terreno di coltura delle cellule produttrici, purificate, quantificate e utilizzate per trasdurre le cellule bersaglio e fornire il complesso cas9 / sgRNA attivo. Le nanolame forniscono il loro carico di ribonucleoproteine (RNP) in modo transitorio e rapido in una vasta gamma di cellule primarie e immortalizzate e possono essere programmate per altre applicazioni, come l’attivazione trascrizionale transitoria di geni mirati, utilizzando proteine Cas9 modificate. Le nanolame sono in grado di modificare il genoma in vivo nel fegato di topi adulti iniettati e negli ovociti per generare animali transgenici. Infine, possono essere complessati con il DNA del donatore per una riparazione diretta all’omologia “senza trasfezione”. La preparazione delle nanolame è semplice, relativamente a basso costo e può essere facilmente eseguita in qualsiasi laboratorio di biologia cellulare.
Rispetto ad altre nucleasi programmabili, il sistema CRISPR-Cas ha notevolmente semplificato e democratizzato la procedura di targeting e scissione del genoma specifico della sequenza nelle cellule eucariotiche. Attraverso la semplice espressione di un sgRNA, gli utenti possono programmare la proteina Cas9 (o varianti ottimizzate) per quasi tutti i locus cellulari1. In questo scenario, la somministrazione della proteina Cas9 e dell’sgRNA diventa la principale limitazione quando si esegue la mutagenesi diretta al sito. Nelle cellule immortalizzate, l’sgRNA e la proteina Cas possono essere facilmente espressi da plasmidi trasfettati per ottenere un efficiente targeting del genoma nella maggior parte delle cellule. Tuttavia, l’espressione costitutiva del complesso Cas9/sgRNA può aumentare l’attività off-target della proteina Cas9 e introdurre cambiamenti indesiderati in loci non specifici2. Nelle cellule primarie, la trasfezione del DNA può essere tecnicamente difficile da raggiungere e portare a una scarsa espressione o a una piccola percentuale di cellule trasfettate. Le alternative alla classica trasfezione del DNA comprendono l’uso di vettori virali che forniscono una codifica transgenica per cas9 e sgRNA o l’elettroporazione della proteina Cas9 ricombinante accoppiata a un sgRNA sintetico. Tuttavia, questi approcci possono portare all’integrazione transgenica all’interno del genoma dell’ospite cellulare (come nel caso dei classici vettori di espressione retrovirale e lentivirale), alla restrizione da parte di fattori cellulari e portare all’espressione costitutiva della proteina Cas9 e dell’sgRNA.
L’elettroporazione del complesso Cas9/sgRNA RNP può superare la maggior parte di questi problemi e portare a una consegna efficiente e transitoria nelle cellule primarie e in vivo, oltre a consentire una risposta dose-dipendente. Tuttavia, di solito si basa su costose attrezzature e reagenti ed è anche difficile da eseguire l’upscaling se è necessario trattare un gran numero di cellule. In alternativa alle tecniche sopra menzionate, questi autori hanno sviluppato “Nanoblades”, un vettore di consegna retrovirale per la proteina Cas9 e sgRNA3 che è concettualmente simile ad altri sistemi di rilascio di proteine del capside derivate da virus4,5,6,7,8. Le nanolame sfruttano la naturale capacità della poliproteina Gag dei retrovirus di produrre, quando espresse da sole in cellule in coltura, VLP che vengono rilasciate nel mezzo extracellulare9. Fondendo la proteina Cas9 all’estremità C-terminale della poliproteina Gag del virus della leucemia murina (MLV) e co-esprimendo glicoproteine sgRNA e involucro virale, la proteina Cas9 può essere incapsulata all’interno di VLP o Nanoblade rilasciati. Al momento della purificazione, le Nanolame possono essere incubate con cellule bersaglio o iniettate in vivo per mediare la consegna rapida, transitoria e dose-dipendente del complesso RNP Cas9/sgRNA3.
Le nanolame possono essere programmate con più sgRNA per l’editing simultaneo in diversi loci o con varianti Cas9 per eseguire altre applicazioni come l’attivazione trascrizionale o la repressione specifica del bersaglio3. A differenza dell’elettroporazione proteica, che si basa sull’espressione ricombinante, le varianti Cas appena descritte dalla letteratura possono essere facilmente clonate nel vettore di espressione di fusione Gag, rendendolo una piattaforma versatile. Le nanolame possono essere ulteriormente complessate o caricate con oligodesossinucleotidi a singolo filamento e doppio filamento (ssODN) per eseguire riparazioni dirette all’omologia3. La produzione di nanolame è relativamente semplice ed economica. Inoltre, le nanolame possono essere conservate a 4 °C per molti giorni o a -80 °C per la conservazione a lungo termine. Tipicamente, le nanolame mediano l’editing del genoma efficiente e privo di transgeni nella maggior parte delle cellule immortalizzate e primarie in coltura. Tuttavia, alcune cellule primarie potrebbero essere sensibili alla presenza di particelle virali, con conseguente aumento della mortalità. Le cellule del sistema immunitario innato possono anche reagire alla presenza di Nanoblade (a causa della loro origine virale) e attivarsi. In questi casi, il protocollo di trasduzione deve essere ottimizzato per limitare il tempo di esposizione alle Nanolame e ridurre al minimo gli effetti non specifici. Le nanolame rappresentano un’alternativa praticabile e facile da implementare ad altri metodi di consegna CRISPR disponibili.
Le nanolame consentono la somministrazione rapida e dose-dipendente del complesso RNP Cas9/sgRNA nelle linee cellulari e nelle cellule primarie. A differenza della trasfezione classica e di altri vettori di consegna virale, ma come l’elettroporazione proteica, le nanolame hanno il vantaggio della consegna transitoria del Cas9 / sgRNA RNP in modo privo di transgene. Nanoblades offre una piattaforma altamente versatile, semplice ed economica per la somministrazione di proteine che può essere facilmente e rapidamente adattata alla famiglia in continua espansione di varianti CRISPR. Le nanolame possono essere prodotte nella linea cellulare HEK293T o nei suoi derivati. Le linee cellulari HEK293T qui utilizzate sono state sviluppate per massimizzare la produzione di particelle retrovirali e lentivirali (vedere la Tabella dei materiali). Tuttavia, sebbene altre fonti di celle HEK293T possano essere adatte, gli utenti devono testare e confrontare le cellule HEK293T da fonti diverse poiché sono state osservate importanti differenze nella produzione di particelle a seconda della sorgente cellulare HEK293T. Le cellule devono anche essere controllate frequentemente per la contaminazione da Mycoplasma e passate ogni tre giorni (classicamente 1/8 di diluizione) per evitare un’eccessiva confluenza, che ha un impatto negativo sulla produzione di particelle.
Le cellule non devono essere mantenute per oltre 20 passaggi. DMEM integrato con glucosio, penicillina / streptomicina, glutammina e il 10% di siero bovino fetale decomplementato è stato utilizzato per la coltura cellulare. Poiché l’origine del siero può influire sulla qualità del preparato Nanoblade, diversi lotti di siero devono essere testati prima della produzione su larga scala. Le nanolame possono essere prodotte in modo efficiente in altri mezzi come RPMI o modifiche prive di siero di un mezzo essenziale minimo che può sostituire DMEM il giorno successivo alla trasfezione. Come indicato di seguito, sebbene la sostituzione del mezzo dopo la trasfezione con alcuni reagenti di trasfezione del DNA sia facoltativa, può essere utile modificare il mezzo in cui vengono rilasciati i VLP, in particolare per limitare le tracce sieriche nella preparazione delle particelle. Tuttavia, la coltivazione di cellule in un mezzo essenziale minimo sierico ridotto il giorno prima della trasfezione non è stata ancora tentata.
Come accennato, le nanolame sono prodotte dopo la sovraespressione di una miscela di plasmidi nelle cellule produttrici. La sovraespressione sembra essere necessaria per una produzione ottimale. In effetti, questo laboratorio ha sviluppato una linea cellulare di produzione in cui il costrutto che esprime Gag-Pol è stato stabilizzato dalla selezione antibiotica; tuttavia, questo sistema non è riuscito a produrre quantità significative di Nanoblade. Un’osservazione simile è stata fatta quando il costrutto di codifica sgRNA è stato stabilmente integrato nel genoma delle cellule produttrici. Come descritto per altri sistemi di produzione di particelle, una linea cellulare stabile che esprima almeno alcuni costrutti coinvolti nella produzione di Nanoblades può essere utile; tuttavia, ciò richiederebbe certamente l’elaborazione di grandi volumi di surnatante e una tecnica appropriata per purificare le particelle. Il protocollo di cui sopra delinea la procedura preferita per produrre Nanoblades che sfrutta specifici reagenti di trasfezione (vedi tabella dei materiali).
Sebbene anche i reagenti di trasfezione di altri produttori siano stati testati con successo, la stragrande maggioranza dei risultati di questo gruppo con Nanoblades segue la procedura descritta nel presente documento. La trasfezione a basso costo può essere ottenuta utilizzando reagenti di fosfato di calcio e produrre una buona efficienza produttiva; tuttavia, questo metodo richiede assolutamente la sostituzione del mezzo di trasfezione il giorno successivo alla trasfezione e può lasciare residui di fosfato di calcio nella preparazione di particelle sedimentate. Coerente con la necessità di alti livelli di espressione per i componenti Nanoblade all’interno delle cellule produttrici è l’osservazione che la quantità di sgRNA associati alla proteina Cas9 può essere un fattore limitante per un efficiente editing del genoma. Per migliorare il carico di sgRNA, due approcci tecnici sono stati recentemente sviluppati da gruppi indipendenti che utilizzano vettori di consegna proteica simili a Nanoblades. Questi si basano sull’uso dell’espressione citoplasmatica T7 polimerasi-dipendente di sgRNA6 o attraverso l’aggiunta di un segnale di incapsidazione retrovirale alla sequenza sgRNA per mediare il legame con la poliproteina Gag6. Questi approcci potrebbero effettivamente migliorare il carico di sgRNA all’interno di Nanoblades anche se non sono ancora stati testati.
La trasduzione delle cellule bersaglio è un passo fondamentale nella procedura. Nella maggior parte delle linee cellulari immortalizzate, la trasduzione con Nanoblades ha poco o nessun effetto citopatico. Tuttavia, nelle cellule primarie, la tossicità può essere un problema. La trasduzione deve quindi essere ottimizzata per ogni tipo di cellula. In particolare, il tempo di esposizione alle Nanoblade è un fattore importante da modificare quando si ottimizza il protocollo di trasduzione. Per le cellule sensibili come i neuroni primari o le cellule del midollo osseo, 4-6 ore di incubazione con Nanoblades prima di sostituire il mezzo consentono una consegna efficiente della proteina Cas9 riducendo al minimo la tossicità cellulare. Inoltre, i coadiuvanti come i polimeri cationici, tra gli altri, possono migliorare significativamente l’efficienza della trasduzione in alcune celle (vedi la Tabella dei materiali). È importante notare che le nanolame sono VLP e possono indurre una risposta immunogenica. Questa può essere una limitazione se si lavora con alcuni tipi di cellule primarie, come macrofagi o cellule dendritiche, in cui l’incubazione con Nanoblades potrebbe indurre importanti cambiamenti nell’espressione genica e nel fenotipo delle cellule. Se i macrofagi e le cellule dendritiche derivano da precursori di cellule staminali ematopoietiche (come le cellule del midollo osseo del topo), è preferibile trasdurre le cellule con le Nanolame prima che siano completamente differenziate per evitare di indurre una risposta cellulare contro le Nanolame. Altrimenti, l’elettroporazione della proteina Cas9 potrebbe rappresentare una valida alternativa quando si lavora con cellule immunitarie differenziate.
Le nanolame possono essere utilizzate in vivo per trasdurre zigoti di topo o embrioni per generare animali transgenici. Simili ai classici vettori retrovirali o lentivirali, possono anche essere iniettati direttamente nei tessuti di animali adulti. Tuttavia, le nanolame (simili ai vettori retrovirali e lentivirali) possono essere inattivate dalla risposta immunitaria dell’animale ospite; pertanto, la dose da iniettare deve essere ottimizzata per ogni applicazione. Questa risposta immunitaria può anche limitare la distribuzione di VLP funzionali ai tessuti vicini al sito di iniezione. Infine, a differenza dei vettori lentivirali, le Nanolame sono prive di transgeni e consegnano il Cas9 in un lasso di tempo limitato. Pertanto, non possono essere utilizzati per eseguire screening funzionali a livello di genoma che richiedono il sequenziamento ad alto rendimento di sgRNA al momento della selezione delle cellule. Le nanolame sono utili quando è richiesta una modifica del genoma rapida, dose-dipendente e senza transgeni20. Inoltre, analogamente all’elettroporazione proteica, le nanolame portano a un minor numero di effetti fuori bersaglio rispetto all’espressione prolungata di Cas9/sgRNA attraverso la trasfezione del DNA o i vettori virali classici3. Lo sviluppo futuro di Nanoblades si concentra sull’incorporazione di varianti Cas9 per diverse applicazioni tecnologiche come l’editing di base e il targeting dell’RNA.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato da Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) dell’Université de Lyon, nell’ambito del programma Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) gestito dall’Agenzia nazionale francese delle ricerche (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) e dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-StG-LS6-805500 a E.P.R.) nell’ambito dei programmi di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione europea.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |