Summary

Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.

Abstract

Celdissociatie is een essentiële procedure geweest voor studies op het niveau van de individuele cel en/of op celpopulatieniveau (bv. RNA-sequencing met één cel en primaire celcultuur). Het leveren van levensvatbare, gezonde cellen in grote hoeveelheden is van cruciaal belang en de optimale omstandigheden om dit te doen zijn weefselafhankelijk. Celpopulaties in het tongepitheel en het onderliggende mesenchyme/bindweefsel zijn heterogeen en weefselstructuren variëren in verschillende regio’s en in verschillende ontwikkelingsstadia. We hebben protocollen getest voor het isoleren van cellen uit het epitheel van de muistong en mesenchym/bindweefsel in de vroege ontwikkelingsfasen [embryonale dag 12,5 (E12,5)] en jongvolwassenen (8 weken). Een schone scheiding tussen het epitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel was eenvoudig te bereiken. Het is echter van cruciaal belang om cellen verder te verwerken en te isoleren, levensvatbare gezonde cellen in grote hoeveelheden op te leveren en zorgvuldige selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, incubatietijd en centrifugeersnelheid en -tijd. Incubatie van gescheiden epitheel of onderliggend mesenchym/bindweefsel in 0,25% Trypsine-EDTA gedurende 30 min bij 37 °C, gevolgd door centrifugeren bij 200 x g gedurende 8 min resulteerde in een hoge opbrengst van cellen met een hoge levensvatbaarheidssnelheid (>90%) ongeacht de muisstadia en tonggebieden. Bovendien ontdekten we dat zowel gedissocieerde epitheel- als mesenchymale/bindweefselcellen van embryonale en volwassen tongen ten minste 3 uur in het celkweekmedium konden overleven zonder een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel. De protocollen zullen nuttig zijn voor studies die de voorbereiding vereisen van geïsoleerde cellen uit muistongs in vroege ontwikkelingsstadia (E12.5) en young adult (8 weken) die celdissociatie van verschillende weefselcompartimenten vereisen.

Introduction

De zoogdiertong is een complex orgaan dat cruciaal is voor smaak, spreken en voedselverwerking. Het bestaat uit meerdere soorten sterk georganiseerde weefsels gecompartimenteerd door mesenchym / bindweefsel en bedekt met een gelaagd epitheelblad met smaakpapillen en smaakpapillen. Celpopulaties in zowel tongepitheel als mesenchym/bindweefsel zijn heterogeen. Om de functies en verdeling van een bepaald type cellen in de tong beter te begrijpen, zijn studies met gedissocieerde cellen nodig. RNA-sequencing met één cel is bijvoorbeeld een krachtige en hoge doorvoermethode voor transcriptomische profilering in afzonderlijke cellen, die is ontworpen om het transcriptoom van complex weefsel te begrijpen bij een eencellige resolutie1,2,3,4. Het is bewezen dat primaire celkweek een nuttig hulpmiddel is om de functie en differentiatie van stam-/voorlopercellen voor smaakpapillen te bestuderen5,6. Deze studies vereisen een grote hoeveelheid hoogwaardige geïsoleerde celpopulaties (bv. voldoende totaal celaantal met de juiste concentratie en hoge levensvatbaarheid).

Er is dus behoefte aan het isoleren van cellen uit verschillende regio’s van de linguale weefsels en in verschillende ontwikkelingsstadia. Momenteel is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Hier rapporteren we een geoptimaliseerde celdissociatiemethode om cellen voor te bereiden op experimenten die een hoge kwaliteit van levende cellen vereisen, zoals voor RNA-sequencing met één cel en primaire stamcelculturen. We ontdekten dat selectie van enzymatische spijsverteringsbuffer, zachte pipetting, selectie van resuspensiemedium en optimale centrifugeertijd en snelheid cruciaal zijn om deze grote hoeveelheden hoogwaardige cellen te genereren.

Protocol

Diergebruik (C57BL/6 muizen gedurende het hele onderzoek) werd goedgekeurd door de University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee en was in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines voor zorg en gebruik van dieren voor onderzoek. 1. Dierlijk gebruik OPMERKING: Muizen werden gefokt en onderhouden in de dierenfaciliteit van de afdeling Dier- en Zuivelwetenschappen van de Universiteit van Georgia bij 22 °C onder 12 uur dag-/nacht…

Representative Results

Scheiding van het tongepitheel van het onderliggende mesenchym/bindweefselIn de embryonale muistong is een opening in de subepitheelruimte zichtbaar na een goede enzymvertering. Epitheelbladen van sommige tongen worden tijdens de incubatie zonder mechanische kracht gescheiden. In de volwassen muistong wordt een succesvolle enzyminjectie aangegeven door de zwelling in de geïnjecteerde gebieden (figuur 1B2), wat sugg…

Discussion

Tot op heden is er geen gedetailleerd protocol beschikbaar voor celdissociatie van het tongepitheel en het onderliggende mesenchym/bindweefsel. Dit huidige celdissociatieprotocol biedt een reproduceerbare procedure om een enkele celsuspensie te genereren met een hoge cel levensvatbaarheid (>90%) van tongweefsels van muizen, met inbegrip van epitheelbladen en mesenchyme/bindweefsels in zowel embryonale als postnatale stadia, ook al zijn geïsoleerde cellen van E12.5 en volwassen muizen verschillend in grootte. Geïsoleerd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health, subsidienummer R01DC012308 en R21DC018089 aan HXL. We danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) en Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) voor technische bijstand en overleg over de celdissociatie; aan Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) voor Engelse bewerking.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

  1. Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
  2. Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
  3. Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  4. Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  5. Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  6. Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  7. Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
  8. Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
  9. Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

View Video