Summary

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Published: February 11, 2021
doi:

Summary

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Abstract

A mucosa intestinal é forrada por uma única camada de células epiteliais que forma uma barreira dinâmica que permite o transporte paracelular de nutrientes e água, evitando a passagem de bactérias luminais e substâncias exógenas. Uma violação dessa camada resulta em maior permeabilidade ao conteúdo luminal e recrutamento de células imunes, ambas marcas de estados patológicos no intestino, incluindo doença inflamatória intestinal (DII).

Os mecanismos que regulam a função da barreira epitelial e a migração transepitelial (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são incompletamente compreendidos devido à falta de métodos experimentais in vivo que permitem análises quantitativas. Aqui, descrevemos um modelo experimental murino robusto que emprega um segmento intestinal exteriorizado de íleo ou cólon proximal. O laço intestinal exteriorizado (iLoop) é totalmente vascularizado e oferece vantagens fisiológicas sobre abordagens baseadas em câmara ex vivo comumente usadas para estudar permeabilidade e migração de PMN através de monocamadas de células epiteliais.

Demonstramos duas aplicações deste modelo em detalhes: (1) medição quantitativa da permeabilidade intestinal através da detecção de dextrans rotulados por fluorescência no soro após injeção intraluminal, (2) avaliação quantitativa do PMN migrado através do epitélio intestinal para o lúmen intestinal após introdução intraluminal de quimioattractants. Demonstramos viabilidade deste modelo e fornecemos resultados utilizando o iLoop em camundongos sem a proteína epitelial associada à junção JAM-A em comparação com os controles. O JAM-A tem sido mostrado para regular a função da barreira epitelial, bem como pmn TEpM durante respostas inflamatórias. Nossos resultados utilizando o iLoop confirmam estudos anteriores e destacam a importância do JAM-A na regulação da permeabilidade intestinal e do PMN TEpM in vivo durante a homeostase e doença.

O modelo iLoop fornece um método altamente padronizado para estudos in vivo reprodutíveis de homeostase intestinal e inflamação e aumentará significativamente a compreensão da função da barreira intestinal e inflamação mucosa em doenças como o DII.

Introduction

A mucosa intestinal abrange uma única camada de células epiteliais intestinais colunares (IECs), células imunes de lamina propria subjacentes e mucosa muscular. Além de seu papel na absorção de nutrientes, o epitélio intestinal é uma barreira física que protege o interior do corpo de bactérias luminais, patógenos e antígenos dietéticos. Além disso, IECs e células imunes lamina propria coordenam a resposta imune induzindo tolerância ou resposta, dependendo do contexto e estímulos. Foi relatado que o rompimento da barreira epitelial pode preceder o aparecimento de inflamação patológica da mucosa e contribuir para a doença inflamatória intestinal (DII) que abrange tanto a colite ulcerativa quanto a doença de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Indivíduos com colite ulcerativa apresentam migração transepitetelial excessiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscessos cripticos, achado que tem sido associado à gravidade da doença8,9. Embora a função da barreira epitelial comprometida e as respostas imunes excessivas sejam marcas do DII, faltam ensaios in vivo experimentais para realizar avaliações quantitativas da permeabilidade intestinal e do recrutamento de células imunes na mucosa intestinal.

Os métodos mais comuns utilizados para estudar a permeabilidade epitelial intestinal e o PMN TEpM empregam abordagens ex vivo baseadas em câmaras usando monocamadas IEC cultivadas em pastilhas de membrana porosa semi-permeável10,11,12. A integridade da barreira epitelial é monitorada por medidas de resistência elétrica transeptelial (TEER) ou pelo flux paracelular do isothionato fluoresceína (FITC) rotulado de dextran de apical ao compartimento basal13,14,15. Da mesma forma, o PMN TEpM é tipicamente estudado em resposta a um quimioattractant que é adicionado na câmara inferior16. O PMN é colocado na câmara superior e após um período de incubação, o PMN que migrou para o compartimento basal são coletados e quantificados. Embora esses métodos sejam úteis, fáceis de executar e muito reprodutíveis, eles são obviamente abordagens reducionistas e não representam necessariamente um reflexo preciso das condições in vivo.

Em camundongos, um ensaio comum para estudar a permeabilidade paracelular intestinal é por gavage oral do FITC-dextran e posterior medição da aparência FITC-dextran no soro sanguíneo13,17. A desvantagem deste ensaio é que representa uma avaliação da integridade geral da barreira do trato gastrointestinal e não da das contribuições regionais intestinais. Além disso, o azul Evans é comumente usado para avaliar vazamento vascular in vivo18 e também tem sido empregado para avaliar a permeabilidade mucosa intestinal em camundongos e ratos19,20,21. A quantificação de Evans azul na mucosa intestinal requer extração de tecido empregando incubação em formamide durante a noite. Portanto, o mesmo tecido não pode ser usado para estudar permeabilidade epitelial intestinal e infiltração de neutrófilos.

Aqui destacamos um protocolo simples que reduz o número de animais necessários para coletar dados reprodutíveis sobre permeabilidade mucosa cólon e migração transepitelial leucócito in vivo. Recomendamos, portanto, o uso de fitc-dextrans que são facilmente detectáveis no soro sanguíneo sem comprometer a integridade das alças intestinais que podem ser colhidas para análise posterior. Note-se que as alças ligadas intestinais têm sido utilizadas em várias espécies (incluindo rato, rato, coelho, bezerro) para estudar infecção bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes e Escherichia coli)22,23,24,25, bem como permeabilidade intestinal26; no entanto, até onde sabemos, não há estudos que investiguem mecanismos de PMN TEpM em regiões específicas do intestino, como íleo ou cólon que estejam comumente envolvidos no IBD.

Aqui descrevemos o modelo de alça intestinal do camundongo (iLoop) que é um método in vivo microcirúrgico robusto e confiável que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado do íleo ou do cólon proximal. O modelo iLoop é fisiologicamente relevante e permite a avaliação da integridade da barreira intestinal e do PMN TEpM em camundongos vivos sob anestesia. Demonstramos duas aplicações: 1) quantificação dos níveis de soro de 4 kDa FITC-dextran após administração intraluminal no iLoop 2) quantificação de PMN transmigrado no lloop lúmen após injeção intraluminal do potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Além disso, utilizando o modelo iLoop com ratos ou ratos jam-a-nulosque abrigam perda seletiva de JAM-A em IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) em comparação com os camundongos de controle, somos capazes de corroborar estudos anteriores que relataram uma grande contribuição para a proteína associada à junção apertada JAM-A à permeabilidade intestinal e transmigração de neutrófilos15,28,29,30,31.

O modelo iLoop é um método altamente funcional e fisiológico que pode ser usado para corroborar ensaios in vitro. Além disso, este é um modelo experimental versátil que permite o estudo de vários reagentes que podem ser injetados no lúmen de loop, incluindo quimiocinas, citocinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticorpos e terapêuticas.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. 1. Preparação pré-operatória NOTA: Este método foi gerado empregando camundongos adultos de origem genética C57BL/6, de 8 a 12 semanas. Todos os camundongos foram mantidos sob rigorosas condições específicas de livre patógenos com acesso a…

Representative Results

Uma representação esquemática dos modelos ileal loop e pcLoop é retratada na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. As imagens anatômicas exibem as etapas críticas do procedimento, incluindo a exteriorização do segmento intestinal (Figura 1B e Figura 2B),identificação de um local apropriado para ligaduras que permite perturbação mínima do suprimento de sangue<strong …

Discussion

Os mecanismos responsáveis pela desregulação da função da barreira intestinal e o recrutamento de células imunes em condições patológicas como o IBD são incompletamente compreendidos. Aqui, detalhamos um modelo robusto in vivo murine que emprega um segmento intestinal exteriorizado bem vascularizado de cólon ileum ou proximal e permite a avaliação da permeabilidade intestinal, estudos de migração de neutrófilos, bem como outras aplicações.

O iLoop é uma cirurgia de não recu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem ao Dr. Sven Flemming da Universidade de Wuerzburg por suas contribuições para o estabelecimento do modelo proximal de laço de cólon, Sean Watson pela gestão das colônias de ratos e Chithra K. Muraleedharan por ajudar na aquisição das fotos do modelo iLoop. Este trabalho foi apoiado pela German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) para KB, R01DK079392, R01DK072564 e R01DK061379 para C.A.P.

Materials

Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

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Boerner, K., Luissint, A., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

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