Этот протокол описывает три метода получения и использования куриных эмбрионов в возрасте от 5 до 8 дней и их хориоаллантоической мембраны (CAM) в качестве модели in vivo для изучения ультразвуковой визуализации с усилением контраста и доставки лекарств, опосредованной микропузырем.
Куриный эмбрион и богатая кровеносными сосудами хориоаллантоидная мембрана (CAM) являются ценной моделью in vivo для исследования биомедицинских процессов, новых схем ультразвуковой пульсации или новых преобразователей для контрастно-усиленной ультразвуковой визуализации и доставки лекарств, опосредованной микропузырем. Причинами этого являются доступность сети эмбрионов и сосудов CAM, а также низкая стоимость модели. Важным шагом для получения доступа к эмбриону и сосудам CAM является извлечение содержимого яиц из яичной скорлупы. В этом протоколе описаны три способа извлечения содержимого из яичной скорлупы между 5 и 8 днями инкубации, что позволяет эмбрионам развиваться внутри яичной скорлупы до наших дней. Описанные методы требуют только простых инструментов и оборудования и дают более высокую выживаемость 90% для 5-дневных, 75% для 6-дневных, 50% для 7-дневных и 60% для 8-дневных инкубированных яйцеклеток по сравнению с ex ovo культивируемыми эмбрионами (~ 50%). Протокол также описывает, как вводить кавитационные ядра, такие как микропузырьки, в сосудистую систему CAM, как отделить мембрану, содержащую эмбрион и CAM, от остального содержимого яйца для оптически прозрачных исследований и как использовать куриный эмбрион и CAM в различных краткосрочных ультразвуковых экспериментах. Модель куриного эмбриона in vivo и CAM чрезвычайно актуальна для исследования новых протоколов визуализации, ультразвуковых контрастных агентов и схем ультразвуковой пульсации для ультразвуковой визуализации с усилением контраста, а также для разгадки механизмов доставки лекарств, опосредованных ультразвуком.
Эмбрионы ex ovo chicken и богатая кровеносными сосудами хориоаллантоидная мембрана (CAM) оказались подходящей моделью для исследования различных биологических и биомедицинских процессов, таких как эмбриогенез, онкология и доставка лекарств 1,2,3,4. Ультразвук использовался для визуализации эмбрионального развития сердца 4,5 и для активации кавитационных ядер при инъекции, таких как микропузырьки, для доставки сосудистых препаратов 6,7. Куриные эмбрионы недороги, требуют меньше инфраструктуры и оборудования и имеют менее строгое законодательство по сравнению с другими моделями животных8. Куриный эмбрион и сосуды CAM легко доступны после вскрытия яйцеклетки, тогда как это оказывается гораздо сложнее с эмбрионами и сосудами млекопитающих. Кроме того, куриный эмбрион и сосуды CAM обеспечивают сердцебиение и пульсирующий кровоток. CAM показывает сходство в анатомии сосудов с млекопитающими и может быть использован для скрининга лекарств 8,9,10. Из-за этих характеристик сосуды CAM также оказались подходящей моделью для исследования контрастной улучшенной ультразвуковой визуализации (CEUS) 11,12,13,14,15,16. Кроме того, модель может быть использована для оптического исследования поведения ультразвуковых контрастных веществ в ультразвуковом поле с помощью сверхскоростной камеры и влияния силы акустического излучения на движение, связывание и экстравазацию лекарств 7,17,18,19. Хотя куриный эмбрион и CAM менее подходят для долгосрочных экспериментов, они могут быть полезны для краткосрочных экспериментов in vivo.
Чтобы повысить видимость и контролируемость над куриным эмбрионом и CAM во время экспериментов, важно удалить содержание яиц, содержащих эмбрион и CAM, из яичной скорлупы18. Предыдущие исследования куриных эмбрионов с использованием ультразвуковых контрастных веществ использовали от 5 до 6-дневных эмбрионов 7,11,12,17,19 и от 14 до 18-дневных эмбрионов 13,14,15,16. Было подробно описано несколько подходов к извлечению содержания яиц из скорлупы 18,20,21. Однако, насколько нам известно, ранее опубликованные подходы сосредоточены на извлечении яичного содержимого из яичной скорлупы после 3 дней инкубации (например, Hamburger & Hamilton (HH) стадии 19-2022) и продолжении культуры ex ovo. Этот подход ex ovo culture имеет множество недостатков, включая повышенный риск смертельных исходов во время культивирования (~ 50%)1,18, использование антибиотиков 18,20 и уменьшение общей длины сосудов по сравнению с ростом ovo 23. Поскольку культивирование эмбриона в яичной скорлупе обеспечивает наиболее естественную среду, легче всего инкубировать эмбрион в яичной скорлупе до дня эксперимента. По этой причине подход, при котором содержание яиц извлекается из яичной скорлупы через 5-8 дней инкубации, был бы полезен, особенно для экспериментов на 5-8-дневных эмбрионах.
В этом протоколе мы описываем три метода извлечения содержимого яиц из яичной скорлупы, когда эмбрион находится на 5-8 дне развития (HH 26-3522), что позволяет эмбриону развиваться в яичной скорлупе до дня эксперимента. Размер сосуда CAM колеблется от 10-15 мкм в диаметре, в меньших капиллярах 8-дневного эмбриона24, до 115-136 мкм в диаметре в более крупном сосуде 6-дневных и 8-дневных эмбрионов 24,25. Три описанных метода требуют только базовых лабораторных инструментов и снижают риск осложнений до начала эксперимента, тем самым уменьшая ненужные затраты и трудозатраты. Мы также подробно описываем метод отделения мембраны, содержащей эмбрион и CAM, от желточного мешка, что делает CAM оптически прозрачным для микроскопических исследований. Поскольку мембрана, содержащая эмбрион и CAM, может быть закреплена, например, на держателе с акустической мембраной, установка также может быть сделана акустически прозрачной26, что позволяет сочетать микроскопию и ультразвуковые исследования, когда световой путь будет затронут желтком. Наконец, мы опишем несколько других ультразвуковых установок, которые можно использовать для ультразвука или визуализации CEUS.
Этот протокол описывает три метода получения и использования куриных эмбрионов в возрасте от 5 до 8 дней и их CAM в качестве модели in vivo для изучения ультразвуковой визуализации с усилением контраста и доставки лекарств, опосредованной микропузырем. Наиболее важными шагами для извлечения 5-дневных (раздел 1.2) и 6-7-дневных (раздел 1.3) эмбрионов из скорлупы являются: 1) сделать небольшое отверстие в верхней части яйца, чтобы пройти через всю яичную скорлупу в воздушный мешок перед извлечением яичного белка; 2) создать гладкие края для большого отверстия в оболочке. Для метода извлечения 8-дневных эмбрионов из скорлупы (раздел 1.4) наиболее важными шагами являются: 1) Сделать достаточное количество углублений для создания красивой трещины вдоль яйца; 2) Держите яйцо погруженным в PBS. Для обеспечения жизнеспособности эмбриона для всех методов важно держать яйцеклетку и ее содержимое при 37 °C. Кроме того, избегайте инъекций в CAM-артерию. Визуальный контроль частоты сердечных сокращений эмбриона во время исследований рекомендуется для обеспечения жизнеспособности эмбриона. Для подтверждения точной стадии развития эмбриона может быть использована индикация Hamburger & Hamilton22.
Важно предотвратить повреждение эмбриона, КАМ и желточного мешка. Это повреждение может повлиять на жизнеспособность, кровоток и видимость эмбриона и CAM. Кроме того, повреждение желточного мешка и, следовательно, низкая жесткость мембраны делает инъекцию в сосуды CAM невозможной. 5-дневный эмбрион имеет относительно небольшой воздушный мешок, поэтому, чтобы иметь возможность сделать достаточно большое отверстие в скорлупе, через которое можно удалить содержимое яйца, необходимо изъять 2 мл яичного белка. В результате создается больше пространства между яичной скорлупой и эмбрионом. После изъятия яичного белка кусочек ленты нужно закрыть отверстие, куда вошла игла. Если яичный белок все-таки вытекает, нанесите еще один кусочек скотча. Кроме того, нанесение ленты на отверстие сбоку создает вакуум внутри яйца, который предотвращает выпадение содержимого яйца из-за собственного веса, когда большое отверстие создается на этапе 1.2.2.8. Повреждение эмбриона или CAM также может произойти, когда край яичной скорлупы был слишком острым или когда содержимое яйца опускается в весовую лодку слишком строго, поэтому яичную скорлупу следует держать очень близко к весовой лодке. Между 5 и 6 днем развития CAM начинает прикрепляться к мембране оболочки32. Это прикрепление увеличивает риск повреждения эмбриона и CAM при извлечении содержимого яйца из яичной скорлупы. Открывая яйцо после инъекции PBS в него для 6-7-дневного инкубированного яйца или в контейнере, наполненном PBS, как описано для 8-дневного инкубированного яйца, риск повреждения снижается. Что касается инъекции в вену CAM: если первая инъекция не удается, вторая инъекция может быть сделана далее вверх по течению в той же вене, если повреждение было незначительным или в другой вене CAM. Отделение эмбриона и CAM от желтка делает эмбрион и сосуды CAM оптически прозрачными. Как следствие, эмбрион теряет свой первичный источник питательных веществ33. Эта потеря питательных веществ может быть объяснением наблюдаемой более низкой частоты сердечных сокращений в 80 уд/мин по сравнению с ~ 190 для 6-дневного эмбриона, который все еще находится в контакте с желтком30, и уменьшенного времени выживания через 2 ч после этой процедуры разделения. Другим фактором, который может играть роль в снижении частоты сердечных сокращений и времени выживания, является задача сохранить разделенный желтком эмбрион и сосуды CAM при 37 ° C. Может быть полезен инкубатор ступени микроскопа. В дополнение к этому, отделение CAM от желтка, вероятно, приводит к механическим изменениям в ткани, поскольку напряжение мембраны становится меньше. Более низкое напряжение мембраны может вызвать увеличение скорости сдвига внутреннего сосуда, что приводит к снижению частоты сердечных сокращений.
Эмбрион ex ovo chicken и сосуды CAM имеют некоторые ограничения в качестве модели in vivo, включая только краткосрочные наблюдения, для контрастной усиленной ультразвуковой визуализации и исследований доставки лекарств, опосредованных микропузырем. Из-за небольшого объема крови 100±23 мкл на 5-й день и 171±23 мкл на6-34-й день можно вводить максимальный объем ~5 мкл. На поздних стадиях развития (7 день и старше) повышается жесткость сосудов и снижается эластичность желтка. Это может осложнить успешную инъекцию в более старые эмбрионы. Как только микропузырьки введены, они циркулируют в течение нескольких часов, потому что куриный эмбрион не имеет полностью развитой иммунной системы на этой стадии35. Таким образом, микропузырьки не очищаются в течение ~ 6 мин, как у людей36,37, что делает типичные ультразвуковые исследования молекулярной визуализации с периодом ожидания 5-10 минут для очистки несвязанных целевых микропузырьков38 невозможно. Для нацеливания на микропузырьки необходимо использовать подходящие лиганды, способные связываться с птичьими эндотелиальными клетками, как описано ранее для маркера ангиогенеза αvβ37. Другими аспектами, которые следует учитывать для этой модели, являются повышенная сложность отделения эмбриона и сосудов CAM от желтка у более старых эмбрионов (> 8 дней) и более низкий гематокрит ~ 20%39 по сравнению с людьми. Последние могут влиять на колебания микропузырьков, поскольку известно, что колебания микропузырьков затухают в более вязкой среде40. Артерии CAM менее насыщены кислородом, чем CAM-вены41,42. Это различие следует учитывать при, например, при изучении фотоакустической визуализации оксигенации крови.
Методы, описанные здесь, позволяют извлекать содержание яиц из яичной скорлупы в день ультразвуковой визуализации или исследования доставки лекарств, как правило, на 5-8 день инкубации. Это отличается от существующих методов, где содержание яиц извлекается из скорлупы после 3-дневной инкубации и далее развивается как ex ovo культура 18,20,21. Преимуществами являются более высокая выживаемость 90% для 5-дневных, 75% для 6-дневных, 50% для 7-дневных и 60% для 8-дневных инкубированных яиц по сравнению с ~ 50% для 3-дневных эмбрионов, извлеченных из яичной скорлупы и дополнительно инкубированных ex ovo 1,18 избегание антибиотиков во время посева 18, 20 и большой стерильный инкубатор для культуры ex ovo. Выживаемость эмбрионов в возрасте от 6 до 8 дней ниже, потому что CAM начинает прикрепляться к оболочке21, что делает мембрану CAM более склонной к разрыву при экстракции. Разделение эмбриона с CAM-формой желтка также описано, что делает эмбрион и CAM оптически прозрачными.
Размещая содержание яиц в различных установках, куриный эмбрион и CAM могут быть использованы для множества ультразвуковых исследований, таких как IVUS, фотоакустических, без или с ультразвуковыми контрастными агентами в 2D и 3D. Основное внимание может быть уделено разработке новых схем ультразвуковой пульсации или тестированию новых преобразователей. Кроме того, модель также может быть использована для исследования новых ультразвуковых контрастных веществ и их поведения в кровеносных сосудах под потоком. Поскольку механизм доставки лекарств, опосредованных микропузырем, до сих пор неизвестен43, использование модели IN VIVO CAM может помочь в выяснении механизма путем изучения поведения микропузырька по отношению к клеточному ответу. Наконец, сосуды CAM оказались подходящей системой для исследования трансплантации опухоли ксенотрансплантата44. Это создает возможность использовать сосуд CAM в качестве модели для исследования визуализации опухоли с помощью ультразвука и для исследования кровотока внутри опухоли с помощью CEUS. Опухоли обычно пересаживают на СОСУДы CAM 8-ти или 9-дневных эмбрионов 1,14,45, для которых эмбрион извлекается из яичной скорлупы на 3-й день инкубации и далее развивается ex ovo. Методы, описанные в этом протоколе, могут быть использованы для выращивания эмбрионов в ово до дня пересадки опухоли.
Авторы полагают, что эта статья будет полезна для исследователей, которые хотят использовать куриные эмбрионы и их хориоаллантоическую мембрану (CAM) в качестве модели in vivo для применения контрастных веществ и исследований потока.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Прикладными и инженерными науками (TTW) (Vidi-project 17543), входящими в состав НМП. Авторы хотели бы поблагодарить Роберта Берскенса, Лукси Вэя и Резу Пакдамана Зангабада из Департамента биомедицинской инженерии и Михиэля Мантена и Герта Спрингелинга из Департамента экспериментального медицинского приборостроения за техническую помощь, все из Медицинского центра Университета Эразмус МС Роттердам, Нидерланды.
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Clamp (Kocher clamp) | |||
Cling film | |||
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) | MABIO, Tourcoing, France | CLINIcell25-50-T FER 00106 | |
Demi water | |||
Disposable plastic Pasteur pipets | VWR | 612-1747 | |
Eggs | Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands | Freshly fertilized | |
Fridge 15 °C | |||
Glass capillary needles | Drummond | 1-000-1000 | Inside diameter: 0.0413 inch |
Heating plate 37 °C | |||
Humidified incubator 37 °C | |||
Insect specimen pins | |||
Metal egg holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B | ||
Metal weighing boat holder | Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D | ||
Microinjection system | FUJIFILM VisualSonics | ||
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-100ML | |
Needle, 19 G | VWR (TERUMO) | 613-5392 | |
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Petri dish, 1 L | Glass | ||
Petri dish, 90 mm diameter | VWR | 391-0559 | |
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) | FUJIFILM VisualSonics | ||
Probe (MS250) | FUJIFILM VisualSonics | 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency | |
Probe (MS550s) | FUJIFILM VisualSonics | transmission frequency of 40 MHz | |
Scalpel | VWR (SWANN-MORTON) | 233-5363 | |
Scissors, small | Fine Science Tools (FST) | 14558-09 | |
Syringe, 5 mL | VWR (TERUMO) | 613-0973 | |
Table spoon | |||
Tape (Scotch Magic tape) | Scotch | ||
Tissue paper | Tork | ||
Tweezers large | VWR (USBECK Laborgeräte) | 232-0107 | See figure 1E |
Tweezers small | DUMONT Medical, Switzerland | 0103-5/45 | See figure 1F |
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) | Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017). | ||
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) | FUJIFILM VisualSonics, Inc. | ||
Ultrasound contrast agent (Definity) | Lantheus medical imaging, United States | ||
Ultrasound gel | Aquasonic | ||
Waxi film (Parafilm) | Parafilm | ||
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) | VWR | 611-0094 |