इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य हैंगिंग बूंदों में सह-संस्कृति कोशिकाओं द्वारा 3डी कार्डियक स्फेरॉइड (सीएसएस) बनाना। कोलेजन-एम्बेडेड सीएसएस को शारीरिक सांद्रता में डॉक्सोरुबिकिन (डॉक्स, एक कार्डियोटॉक्सिक एजेंट) के साथ मॉडल हार्ट फेलियर के साथ इलाज किया जाता है। डॉक्स-इलाज CSs का उपयोग कर में विट्रो परीक्षण दिल की विफलता के रोगियों के लिए उपन्यास चिकित्सा की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग में कई प्रगति के बावजूद, दूर करने के लिए प्रमुख चुनौतियों में से एक पूरी तरह से कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की पीढ़ी बनी हुई है जिसमें जैव इंजीनियरिंग हृदय ऊतकों के भीतर ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करने के लिए जटिलता के कई स्तर शामिल हैं। हमारी प्रयोगशाला ने मानव हृदय का एक त्रि-आयामी इन विट्रो मॉडल विकसित किया है, जिसे “कार्डियक स्पेरोइड” या “सीएस” के रूप में जाना जाता है। यह मानव हृदय की विशिष्ट जैव रासायनिक, शारीरिक और औषधीय विशेषताएं प्रस्तुत करता है और अपने तीन प्रमुख सेल प्रकारों जैसे कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को सह-रूप से उत्पन्न करता है। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPSC-CMs या iCMs) तीन से चार दिनों के लिए ड्रॉप संस्कृति प्लेटों में मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट (HCFs) और मानव कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल (HCAECs) के साथ वीवो में पाए जाने वाले अनुपात में सह-संस्कारी हैं । कार्डियक ट्रोपोनिन टी, सीडी 31 और विमेंटिन (कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के लिए मार्कर क्रमशः) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग सीएसएस के कॉन्फोकल विश्लेषण से पता चलता है कि सीएसएस एक जटिल एंडोथेलियल सेल नेटवर्क पेश करता है, जो मानव हृदय में पाए जाने वाले देशी जैसा दिखता है। इसकी पुष्टि इन कॉन्फोकल छवियों के 3डी रेंडरिंग विश्लेषण से होती है। सीएसएस मानव हृदय के विशिष्ट एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन भी प्रस्तुत करता है, जैसे कोलेजन टाइप IV, लैमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन। अंत में, सीएसएस एक अनुबंध गतिविधि प्रस्तुत करता है जिसे सिंक्टाइल अनुबंध के रूप में मापा जाता है जो केवल आईसीएम होते हैं, जो सीएसएस की तुलना में मानव हृदय के एक विशिष्ट के करीब होता है। जब कार्डियोटॉक्सिक एंटी-कैंसर एजेंट के साथ इलाज किया जाता है, जैसे डॉक्सोरुबिक (डीओएक्स, ल्यूकेमिया, लिंफोमा और स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है), DOX-इलाज सीएस की व्यवहार्यता एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस के 10 माइक्रोन आनुवंशिक और रासायनिक अवरोध पर काफी कम हो जाती है, एचसीएफ और एचसीएईएस में डीओएक्स का डाउनस्ट्रीम लक्ष्य, एचसीएफ और एचसीएईएस में डॉक्स का डाउनस्ट्रीम लक्ष्य, विषाक्त इन अनूठी विशेषताओं को देखते हुए, सीएसएस वर्तमान में दिल जैव रसायन, रोगविज्ञान, और फार्माकोलॉजी का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है।
मानव हृदय में सीमित पुनर्योजी क्षमता है जबकि हृदय रोग (सीवीडी) ऊतक इंजीनियरिंग और स्टेम सेल प्रौद्योगिकियों में हाल ही में हुई प्रगति के बावजूद दुनिया भर में मौत का मुख्य कारण बना हुआ है1। क्षतिग्रस्त हृदय की मरम्मत या दिल को असफल होने से रोकने के लिए आणविक और सेलुलर दृष्टिकोण सहित उपन्यास चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता हृदय रोग से पीड़ित रोगियों के लिए प्रमुख वर्तमान नैदानिक आवश्यकताओं में से एक है2,3,4. कार्डियक टिश्यू इंजीनियरिंग का मुख्य लक्ष्य एक त्रि-आयामी (3 डी) हृदय ऊतक बनाना है जो मानव हृदय की विशिष्ट आणविक, सेलुलर और बाह्य विशेषताओं को प्रस्तुत करता है, जिसमें इसके संवहनी नेटवर्क और शारीरिक संकुचन कार्य4,5,6शामिल हैं।
बायोइंजीनियर और एक कार्यात्मक मानव हृदय ऊतक बनाने के लिए जो इन विट्रो और वीवो अनुप्रयोगों के लिए मानव हृदय की नकल करता है, कई दृष्टिकोणों की जांच की गई है जिनमें इंजीनियर हृदय ऊतक (ईएचटी), सेल शीट और गोलाकार संस्कृतियां7,8शामिल हैं। हालांकि, ये ऊतक मानव हृदय के विशिष्ट इष्टतम 3डी माइक्रोएनवायरमेंट को पुनः प्राप्त करने में विफल हो जाते हैं और सीवीडी रोगियों के लिए उनके संभावित उपयोग सीधे बेंच से बेडसाइड7में अनुवाद नहीं कर सकते हैं। इसका कारण यह है कि वे वीवो हृदय ऊतकों में जटिल जीव विज्ञान, आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान9को फिर से नहीं करते हैं। कार्डियक ऊतक इंजीनियरिंग में प्रमुख चुनौतियों में से एक में बायोइंजीनियर्ड कार्डियक ऊतक के भीतर एक पदानुक्रमित संवहनी नेटवर्क का विकास शामिल है, क्योंकि व्यास में 200 माइक्रोन से बड़ा कोई भी ऊतक मध्य2,10में सेल मृत्यु विकसित करता है। मानव हृदय ऊतक में एक ठीक से गठित संवहनी नेटवर्क हृदय कोशिकाओं को रक्त, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए एक प्रमुख भूमिका निभाता है11। भ्रूणीय विकास के दौरान, कोरोनरी केशिकाएं और धमनियां वैक्यूलोजेनेसिस (डी नोवो रक्त वाहिका निर्माण) और एंजियोजेनेसिस (पूर्व-मौजूदा लोगों से रक्त वाहिकाओं की पीढ़ी) के माध्यम से एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाओं से8,12। कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट इष्टतम एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और विकास संरचना13,14प्रदान करके उचित संवहनी नेटवर्क गठन में भी प्रमुख भूमिका निभाते हैं।
बायोइंजीनियर्ड हार्ट टिश्यू का 3डी वैस्कुलर नेटवर्क ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के ग्रेडिएंट और पैराक्रिन सिग्नलिंग बनाकर सेल सर्वाइवल और फंक्शन को नियंत्रित करता है, जैसे होमोसाइलिक सेल इंटरैक्शन, हेटेरियोपिक सेल इंटरैक्शन, स्रावित घुलनशील प्रोटीन और सेल टू ईसीएम इंटरैक्शन के जरिए कोशिकाओं की बातचीत3,10,15,16,17, 18। यह ऊतकों के बीच में कोशिका मृत्यु को रोकता है और बायोइंजीनियर्ड हृदय ऊतकों में कोशिका व्यवहार्यता और शारीरिक कार्य को बढ़ावा देता है16,18,19.
स्टेम सेल से स्पेरोइड संस्कृतियों को हाल ही में मानव हृदय20के इन विट्रो मॉडल के रूप में खोजा गया है । विट्रो में कार्डियक माइक्रोएनवायरमेंट को और बेहतर बनाने के लिए उन्होंने मानव हृदय में पाए जाने वाले सभी मुख्य कोशिका प्रकारों जैसे कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग को शामिल किया है। स्फेरॉयड संस्कृतियां कोशिकाओं के विकास और कार्य करने के लिए आवश्यक 3डी संरचनात्मक सहायता प्रस्तुत करती हैं और इसका उपयोग एक संवहनी नेटवर्क 14 , 20 ,21,22के लिए किया जा सकताहै। इस संदर्भ में, हमारी प्रयोगशाला ने मानव हृदय14में पाए जाने वाले अनुपात में कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट को सह-संस्कृति द्वारा मानव हृदय स्फेरॉइड (सीएसएस) विकसित किया है। यह मॉडल रैट वेंट्रिकुलर कार्डियक कोशिकाओं स्फेरॉइड मॉडल का विस्तार है, जो हैंगिंग ड्रॉप संस्कृतियों में कार्डियक कोशिकाओं को सह-संस्कृति से उत्पन्न करता है, जो कार्डियक फाइब्रोसिस21को मॉडल करने के लिए उपयोग किया जाता है। मानव CSs विषाक्तता परख के रूप में उन्हें डॉक्सोरुबिकिन (DOX, एक विरोधी कैंसर ल्यूकेमिया, लिंफोमा और स्तन कैंसर के इलाज के लिए इस्तेमाल एजेंट) के इलाज के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से हृदय फाइब्रोसिस और दिल की विफलता (एचएफ) प्रेरित करने के लिए जाना जाता है यहां तक कि 17 साल अपने somministration14के बाद ।
इस पांडुलिपि में, हम वर्णन करते हैं कि मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीसी-सीएम या आईसीएएमएस), मानव हृदय फाइब्रोब्लास्ट (एचसीएफ) और मानव कोरोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल (एचसीएईसी) द्वारा मानव सीएसएस को लटकाने वाली ड्रॉप संस्कृतियों में कैसे उत्पन्न किया जाए। इन विट्रो परीक्षण के लिए उपयोग और छवि सीएसएस के लिए, वे कोलेजन जेल में एम्बेडेड हैं। सीडी 31 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग सीएसएस के कॉन्फोकल विश्लेषण, एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक मार्कर, पता चला है कि इन कोशिकाओं को एक वीवो में मनाया एक के समान नेटवर्क के रूप में । एचएफ और संभावित परीक्षण उपन्यास एजेंटों को प्रेरित करने के लिए जो इसका इलाज कर सकते हैं या इसे रोक सकते हैं, सीएसएस को 10 माइक्रोन डीओएक्स (दवा प्राप्त करने वाले कैंसर रोगियों के खून में पाई जाने वाली एकाग्रता) के साथ इलाज किया गया था। जब कैल्सेइन-एएम और एथिडियम होमोमर (क्रमशः लाइव और मृत कोशिकाओं को धुंधला करना) से सना जाता है, तो डीओएक्स-इलाज किए गए सीएसएस ने दवा प्राप्त नहीं करने वाले सीएसएस की तुलना में व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी पेश की। सीएसएस 1 और 3 हर्ट्ज के बीच क्षेत्र संभावित उत्तेजना का उपयोग करते समय एक सजातीय अनुबंधीय गतिविधि भी पेश करता है।
मानव हृदय10, 12,23, 24, 25, 26सहित कार्यात्मक ऊतकों के उत्पादनकेलिए उचित संवहनी नेटवर्कगठनमहत्वपूर्ण है। 3 डी ऊतकों के उचित संवहनी के लिए विचार ऑक्सीजन, विकास कारकों, संकेत अणुओं और पोषक तत्वों के आदान-प्रदान की अनुमति देता है, जो किसी भी ऊतक के भीतर कोशिका परिगलन के विकास को 200 माइक्रोन6,10, 12,17,24,25,26, 27,28से मोटा होता है। वर्तमान में विट्रो 3 डी हार्ट मॉडल में उपलब्ध है जो एक संवहनी नेटवर्क प्रस्तुत करते हैं, मुख्य रूप से केशिका-आकार, अव्यवस्थित संवहनी नेटवर्क पेश कर रहे हैंऔर वीवो6,8,29में देखे गए पदानुक्रमित जटिल शाखाबद्ध संवहनीकरण की कमी है। इस पांडुलिपि में वर्णित जटिल कार्डियक एंडोथेलियल सेल नेटवर्क विकसित करने का वैकल्पिक दृष्टिकोण मौजूदा मॉडलों की तुलना में बेहतर कोशिका व्यवहार्यता और कार्य प्रस्तुत करता है (चित्र 1,14,22. 3डी इन विट्रो सीएसएस मानव हृदय को वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में बेहतर रीकैपिटल करके मॉडल करता है, जिसमें इसके आणविक, सेलुलर और बाहुलर घटक14,22शामिल हैं । फांसी की बूंदों में स्टेम सेल-व्युत्पन्न कोशिकाओं से सीएस पीढ़ी अपनी संस्कृतियों को परिभाषित स्थितियों (जैसे, सेल प्रकार और अनुपात, उचित ऊतक निर्माण) में अनुमति देती है। सीएसएस के भीतर एचसीएफ और एचसीएईसी के साथ आईसीएएमएस की सह-संस्कृतियों ने आणविक और सेलुलर क्रॉसटॉक को परिभाषित किया है जो हृदय रोगविज्ञान को नियंत्रित करता है, जिसमें इसके संकुचन कार्य और रोगी के खून में पाई जाने वाली सांद्रता पर दवाओं की प्रतिक्रिया शामिल है14। इन अनूठी विशेषताओं के कारण, सीएसएस का उपयोग मॉडल कार्डियक फाइब्रोसिस के लिए किया गया है, जो मायोकार्डियल इन्फेक्शन और हार्ट फेलियर21का गंभीर परिणाम है। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कैसे एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों की उपस्थिति मानव हृदय में संवहनी माइक्रोएनवायरमेंट के पुनर्पूंजीकरण के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे फाइब्रोब्लास्ट-व्युत्पन्न ईसीएम प्रोटीन, जैसे लेमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन प्रकार IV के इष्टतम जमाव की अनुमति दी गई है, जो एक विकासशील एंडोथेलियल सेल नेटवर्क14,21के निकट स्थानीय है।
DOX एक प्रसिद्ध कार्डियोटॉक्सिक दवा है जो कैंसर रोगियों में उनके इलाज30के 17 साल बाद भी दिल की विफलता विकसित कर सकती है । फिर भी, यह30महिलाओं में बाल रोगियों और स्तन कैंसर में ल्यूकेमिया और लिंफोमा के इलाज के लिए पसंद की दवा बनी हुई है। सीएसएस में DOX उपचार तो मॉडल दिल की विफलता (एचएफ) विट्रो में दोनों कार्डियक मायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट14 में विषाक्तता को विनियमित करने के लिए और मॉडल एचएफ प्रेरित हृदय फाइब्रोसिस21में विषाक्तता को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया गयाहै । कोशिका व्यवहार्यता सांख्यिकीय 24 घंटे के भीतर DOX इलाज CSs में कम किया गया था जब कैंसर रोगियों के खून में पाया एकाग्रता पर दवा के संपर्क में (5 और 10 μM के बीच)14 (चित्रा 2)। हमारी प्रयोगशाला में पिछले अध्ययनों ने इस सिग्नलिंग पाथवे14के आनुवंशिक और रासायनिक अवरोधकों का उपयोग करके एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (एनओएस) के माध्यम से कार्डियक एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट दोनों पर डॉक्स के जहरीले प्रभावों का भी प्रदर्शन किया। आनुवंशिक (एनओएस 3 श्र्ना) और रासायनिक (एन5-(1-इमिनोएथिल) के उपयोग-एल-ऑर्निथिन, डाइहाइड्रोक्लोराइड, या एल-एनआईओ) एनओएस सिग्नलिंग मार्ग के विरोधी डीओएक्स के डाउनस्ट्रीम लक्ष्य के रूप में कार्डियक एंडोथेलियल कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट14दोनों में इसके जहरीले प्रभावों को रोकते हैं।
सीएसएस के भीतर अनुबंध गतिविधि भी क्षेत्र संभावित उत्तेजना के संपर्क में आने पर हृदय कोशिकाओं के विद्युत युग्मन के लिए धन्यवाद मापा गया है। हमने पाया कि सीएसएस नियंत्रण मीडिया (DOX 0 μM) अनुबंध के साथ सुसंस्कृत अनायास और समरूप रूप से एक पिटाई दर है कि 1 और 3 हर्ट्ज के भीतर क्षेत्र उत्तेजना द्वारा पुस्तक किया जा सकता है, एक स्वस्थ मानव दिल के साथ तुलनीय पर । दूसरी ओर, DOX-इलाज CSs विद्युत उत्तेजना का पालन नहीं करते क्योंकि वे अनुबंध नहीं कर सकते हैं। कैल्सीन-एएम और एथिडियम होमोमर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता और विषाक्तता के मापन के साथ, सीएस अनुबंधीय कार्य के लिए यह कार्यात्मक परख विट्रो में मानव हृदय के विशिष्ट जटिल परिदृश्य के मूल्यांकन की अनुमति देता है, वर्तमान में अन्य मॉडलों के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है। एक ही प्रणाली का उपयोग कर एकल हृदय कोशिकाओं के संकुचन गतिविधि माप की तुलना में, हम कल्पना और CSs में सारकोमेरे उपाय करने में सक्षम नहीं हैं । इसलिए, हम समय के साथ छोटा% स्फेरॉइड के माप तक ही सीमित हैं, एक परख हमें अपनी प्रयोगशाला के भीतर विकसित करना था। जैसा कि हम कोशिकाओं की संख्या को नियंत्रित करते हैं, हम प्रत्येक सीएस में सह-संस्कृति और इसलिए प्रत्येक सीएस के आकार, हम समान आकार के साथ सीएसएस का उपयोग करते हैं जो वास्तव में समरूप संकुचन कार्य पेश करते हैं। हालांकि, यदि हमने विभिन्न आकारों के सीएसएस उत्पन्न किए हैं, तो भी उनकी अनुबंध गतिविधि नहीं बदली।
यह रिपोर्ट करना भी महत्वपूर्ण है कि सीएसएस की बहुकोशिकीय प्रकृति उन्हें आयन-ऑप्टिक्स सिस्टम में कवरस्लिप के तल पर स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त भारी बनाती है, भले ही वे अतितरित हों। इस तथ्य के आधार पर कि सीएसएस खुद को एक विशिष्ट स्थिति में बैठते हैं, हमें उन्हें कवरलिप का पालन करने की आवश्यकता नहीं है, जो आमतौर पर अधिकांश प्रयोगशालाओं में एकल हृदय कोशिकाओं के साथ किया जाता है।
कार्डियक ट्रोपोनिन टी, सीडी 31/पेकैम, और पेकैम (क्रमशः आईसीएएमएस, एचसीएईसी और एचसीएफ के लिए मार्कर के रूप में) के खिलाफ एंटीबॉडी से सना हुआ सीएसएस के सूक्ष्म विश्लेषण ने एंडोथेलियल सेल नेटवर्क(चित्रा 1,नीला) का गठन दिखाया। सीएसएस के भीतरी हिस्से में परिगलन को पूरी तरह से बाहर करने के लिए, कैल्सीन-एएम/एथिडियम होमाडिमर दाग सीएसएस(डेटा नहीं दिखाएगए) के कॉन्फोकल विश्लेषण द्वारा हमारी प्रयोगशाला में सेल व्यवहार्यता का स्थानिक मूल्यांकन किया गया था। हालांकि, यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि बायोफैब्रिकेशन क्षेत्र में भविष्य की घटनाओं को बेहतर तरह से वीवो में मानव हृदय की विशिष्ट अन्य जटिल विशेषताओं को फिर से रीकैपिटेट करने के लिए, वर्तमान में मौजूदा मॉडल में उपलब्ध नहीं है। इनमें शामिल हैं: i) वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स की विशिष्ट अनुबंधीय कार्य; ii) रक्त प्रवाह और दबाव बल; iii) पैराक्रिन सिग्नलिंग; iv) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, जो इस और अन्य इन विट्रो कार्डियक मॉडल6में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण होगा . जैसा कि किसी भी अन्य मॉडल का उद्देश्य स्वस्थ ऊतक या रोग राज्य की प्रमुख विशेषताओं का पुनर्मूल्यांकन करना है, इस पांडुलिपि में वर्णित सीएस की पीढ़ी और उपयोग के लिए प्रोटोकॉल का उद्देश्य विशिष्ट प्रश्नों को संबोधित करने में शोधकर्ता की मदद करना है, जो इस दृष्टिकोण का उपयोग करके संपूर्ण नहीं हो सकता है। उदाहरण के लिए, सीएसएस की पीढ़ी के लिए रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं का संभावित उपयोग व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए उपकरण प्रदान करेगा, वर्तमान में हृदय अनुसंधान के लिए आमतौर पर उपलब्ध उच्च थ्रूपुट परख का उपयोग करके उपलब्ध नहीं है।
अंत में, हमने हृदय कोशिकाओं का उपयोग करके मानव हृदय माइक्रोएनवायरमेंट को बेहतर तरह से पुनः प्राप्त करने का एक सरल तरीका प्रदर्शित किया। कार्डियक स्फेरॉइड एक एंडोथेलियल सेल नेटवर्क पेश करते हैं जो हृदय कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियों की तुलना में मानव हृदय में मौजूद एक को बेहतर रीकैपिटुलेट करता है। उनकी अनूठी विशेषताओं को देखते हुए, वे हृदय अनुसंधान के लिए इन विट्रो परीक्षण के लिए उन्नत उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर भविष्य के अध्ययन दोनों को रोकने और बेहतर हृदय रोग के इलाज के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा और उपन्यास चिकित्सा के लिए विकल्प प्रदान कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
रिकॉर्डिंग और वीडियो संपादन के लिए नेट जॉनसन के लिए एक विशेष धन्यवाद।
पूनम शर्मा को यूनिप्र्स और यूएनआरएस सेंट्रल एंड फैकल्टी स्कूल (यूएनआरएससी 5050) छात्रवृत्तियों के साथ न्यूकैसल विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। कारमाइन गेंटाइल को यूटीएस सीड फंडिंग, एडल्ट स्टेम सेल रिसर्च के लिए सिडनी ग्रांट के कैथोलिक आर्कसूबा और सिडनी मेडिकल स्कूल फाउंडेशन कार्डियोथोरेसिक सर्जरी रिसर्च ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था।
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |