このプロトコルは、吊り下げ低下中の細胞を共培養することによって3D心臓スフェロイド(CD)を製造することを目的としています。コラーゲン埋め込みCDは、心不全をモデル化するために生理学的濃度でドキソルビシン(DOX、心毒性剤)で治療される。DOX治療のCDを用いたインビトロ検査は、心不全患者に対する新規治療法を同定するために用いることができる。
心臓組織工学のいくつかの進歩にもかかわらず、克服するための主要な課題の1つは、生体工学された心臓組織内の酸素および栄養素を提供するために、いくつかのレベルの複雑さを含む完全に機能する血管ネットワークの生成のままである。当研究室では、心臓スフェロイドまたはCSと呼ばれるヒト心臓の3次元インビトロモデルを開発しました。これは、人間の心臓の典型的な生化学的、生理学的、および薬理学的特徴を提示し、心臓筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞などの3つの主要な細胞タイプを共培養することによって生成される。ヒト誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞(hiPSC-CMまたはiCM)は、3〜4日間の吊り下げ培養プレート中のヒト心臓線維芽細胞(HFF)およびヒト冠動脈内皮細胞(HCAIC)と共培養される。心臓トロポニンT、CD31およびビメンチン(それぞれ心臓筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞のマーカー)に対する抗体で染色されたCSsの共焦点分析は、CSがヒト心臓に見られる天然細胞ネットワークに似た複雑な内皮細胞ネットワークを提示することを示している。これは、これらの共焦点画像の 3D レンダリング解析によって確認されます。また、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質、例えばコラーゲン型IV型、ラミニンおよびフィブロネクチンを有する。最後に、CDは、iCMのみを含むCDと比較して、人間の心臓の典型的な収縮性に近いと測定される収縮活性を提示する。ドキソルビシン(DOX、白血病、リンパ腫、乳癌の治療に使用されるDOX)などの心毒性抗癌剤で治療すると、DOX処置されたCSの生存率は、DOX inFs HCFsおよびHCAIcの下流標的である内皮一酸化窒素合成酵素の10μMの遺伝的および化学的阻害で有意に減少する。これらのユニークな特徴を考えると、CSは現在、心臓生化学、病態生理学、薬理学を研究するためにインビトロモデルとして使用されています。
心臓血管疾患(CVD)は、組織工学と幹細胞技術の最近の進歩にもかかわらず、世界的に死の主な原因である一方で、人間の心臓は再生能力が限られています1.損傷した心臓を修復するか、心臓の障害を防ぐための分子および細胞アプローチを含む新しい治療法の必要性は、心臓病2、3、4に罹患している患者にとって現在の主要な臨床ニーズの1つである。心臓組織工学の主な目的は、血管ネットワークおよび生理的収縮機能4、5、6を含む、ヒト心臓の典型的な分子、細胞、および細胞外特徴を提示する3次元(3D)心臓組織を作製することである。
生体工学と生体外および生体内の適用のために人間の心臓を模倣する機能的なヒト心臓組織を製造するために、いくつかのアプローチが、設計された心臓組織(EHTs)、細胞シートおよびスフェロイド培養7、8を含む調査されている。しかし、これらの組織は、ヒト心臓の典型的な最適な3D微小環境を再現し、CVD患者に対するそれらの潜在的な使用は、ベンチからベッドサイド7に直接翻訳できない。これは、生体内心臓組織の複雑な生物学、形態、生理学を再現しないためです。心臓組織工学における主要な課題の1つは、生体工学された心臓組織内の階層的血管ネットワークの開発を含み、直径200μmを超える組織が中間2,10で細胞死を発症する。ヒト心臓組織における適切に形成された血管ネットワークは、心臓細胞11への血液、酸素および栄養素の供給に大きな役割を果たす。胚発生時に、冠状動脈毛細血管および動脈は血管形成(脱ノボ血管形成)および血管新生(既存血管の形成)を介して形成される(既存の血管から血管の生成)内皮前駆細胞8,12から。心臓線維芽細胞はまた、最適な細胞外マトリックス(ECM)および成長組成物13、14を提供することにより、適切な血管ネットワーク形成において主要な役割を果たす。
生体工学に基いた心臓組織の3D血管ネットワークは、均質な細胞相互作用、異種細胞相互作用、分泌された可溶性タンパク質および細胞を介した細胞の相互作用3、10、15、16、17、18などの酸素および栄養勾配およびパラクリンシグナル伝達を作成することによって細胞の生存および機能を制御する。これは、組織の途中で細胞死を防ぎ、生体工学心臓組織16、18、19における細胞生存率および生理機能を促進する。
幹細胞由来のスフェロイド培養は、ヒト心臓20のインビトロモデルとして最近探求されている。さらに、インビトロで心臓微小環境を改善するために、心臓筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞など、ヒト心臓に見られるすべての主要な細胞タイプの使用が含まれています。スフェロイド培養物は、細胞が成長し、機能するために必要な3D構造サポートを提示し、血管ネットワーク14、20、21、22をバイオエンジニアリングするために使用することができる。この文脈で、我々の研究室は、心臓筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞をヒト心臓14に見られる比率で共培養することによって、ヒト心臓スフェロイド(CS)を開発した。このモデルは、ラット心室心房スフェロイドモデルの拡大であり、吊り下げ低下培養物中で心臓細胞を共培養して生成し、心臓線維症21をモデル化するために用いられる。ヒトCDは、ドキソルビシン(DOX、白血病、リンパ腫および乳癌の治療に使用される抗癌剤)を治療することによって毒性アッセイとして使用することができ、これは、その支配14後17年も心臓線維症および心不全(HF)を誘発することがよく知られている。
本稿では、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CMまたはiCM)、ヒト心筋線維芽細胞(HTF)、ヒト冠動脈内皮細胞(HCAIC)を吊り下げ培養で共培養することによりヒトCDを生成する方法を説明する。インビトロ検査に使用して画像CDを使用するために、コラーゲンゲルに埋め込まれています。内皮細胞のマーカーであるCD31に対する抗体で染色されたCSsの共焦点解析は、これらの細胞が生体内で観察されたものと同様のネットワークを形成することを示した。HFを誘導し、それを治療または予防する可能性のある新しい薬剤を潜在的に試験するために、CSは10 μM DOX(薬物を受けている癌患者の血流中に見られる濃度)で治療された。カルセインAMおよびエチジウムホモジマー(それぞれ生細胞と死細胞の染色)で染色すると、DOX処理されたCDは、薬物を受け取らなかったCSと比較して生存率の有意な減少を示す。また、1~3Hzの間の電界電位刺激を使用してペースを合うと、同種の収縮活性を示します。
発達的には、適切な血管ネットワーク形成は、ヒト心臓10、12、23、24、25、26を含む機能的組織の生成にとって重要である。3D組織の適切な血管化に関する考察は、酸素、成長因子、シグナル伝達分子および栄養素の交換を可能にし、200 μm6、10、12、17、24、25、26、27、28より厚いあらゆる組織内の細胞壊死の発生を防止する。血管ネットワークを呈するin vitro 3D心臓モデルは、主に毛細管サイズの組織化されていない血管ネットワークを提示しており、生体内6、8、29において観察される階層的に複雑な分岐血管化を欠いている。本稿に記載された複雑な心臓内皮細胞ネットワークを開発する代替アプローチは、既存のモデル(図1)14,22と比較して細胞の生存率と機能が向上した。3D in vitro CSsは、その分子、細胞および細胞外成分14、22を含む生体内微小環境をより良く再現することによって、ヒト心臓をモデル化する。吊り下げ液中の幹細胞由来細胞からのCS生成は、定義された条件(例えば、細胞タイプおよび比率、適切な組織形成)においてそれらの培養を可能にする。CS内のHFFおよびHcAICと共にiCMの共同培養は、患者の血流14に見られる濃度における収縮機能および薬物への応答を含む、心臓病理生理を調節する分子および細胞クロストークを定義する。これらのユニークな特徴のために、CSは心筋線維症、心筋梗塞および心不全21の重篤な結果をモデル化するために利用されてきた。我々のこれまでの研究は、内皮細胞と線維芽細胞の両方の存在がヒト心臓における血管微小環境の再現にとっていかに重要であるかを示し、ラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲン型IVなどの線維芽細胞由来ECMタンパク質の最適な堆積を可能にし、現像する内皮細胞ネットワーク14、21の近くに局在する。
DOXは、治療後17年でもがん患者に心不全を発症する可能性のある、よく知られた心毒性薬です 30.それにもかかわらず、それは、小児患者における白血病およびリンパ腫および女性30における乳癌の治療のための選択の薬であり続ける。次いで、心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞14における毒性を調節するメカニズムを研究するために、インビトロで心不全(HF)をモデル化し、HF誘導心臓線維症21をモデル化するために、CDSにおけるDOX治療が用いられている。癌患者の血流中に見られる濃度で薬物に曝露した場合、24時間以内にDOX処置CDにおいて細胞生存率が統計的に低下した(図2)。我々の研究室での以前の研究はまた、このシグナル伝達経路の遺伝的および化学的阻害剤の両方を用いて内皮一酸化窒素シンターゼ(eNOS)を介して心臓内皮細胞および線維芽細胞の両方に対するDOXの毒性作用を実証した。遺伝性(NOS3 shRNA)および化学(N5-(1-イミノエチル)-L-オルニチン、ジヒドロクロリド、またはL-NIO)のアンタゴニストをDOXの下流標的として使用することにより、心臓内皮細胞および線維芽細胞の両方で毒性作用を防いだ。
また、CS内の収縮活性は、フィールド電位刺激にさらされると心細胞の電気結合のおかげで測定された。制御媒体(DOX 0 μM)を用いて培養したCDは、健康な人の心臓に匹敵する1Hzと3Hz以内のフィールド刺激によってペースアップできる拍動速度で自発的かつ均質に収縮することを発見した。一方、DOX処理のCDは収縮できないため、電気刺激に従わない。カルセインAMおよびエチジウムホモジマーを用いた細胞生存率および毒性の測定と共に、CS収縮関数に対するこの機能アッセイは、ヒト心臓の典型的な複雑なシナリオをインビトロで評価することを可能にし、現在のところ他のモデルでは達成できない。同じシステムを用いた単一心細胞の収縮活動測定と比較して、我々は、CDでサルコメアを可視化し、測定することができない。したがって、我々は時間の経過とともに%スフェロイドの短縮の測定に限定され、我々は我々の研究室内で開発しなければならなかったアッセイ。細胞の数を制御し、各CSで共培養し、各CSのサイズを持つため、同種の収縮機能を有する同じような大きさのCSを利用します。しかし、サイズの異なるCDを生成しても、収縮活動は変わらなかった。
また、複数の細胞性のCDが、Ion-Optixシステムのカバースリップの下部に局在するほど重くなっていることを報告することも重要です。特定の位置に座っている事は、ほとんどの研究室で一般的に単一の心臓細胞で行われていることとは逆に、CSsが単独で座っているという事実に基づいて、我々は彼らがカバーリップに付着させる必要はありません。
心臓トロポニンT、CD31/PECAM、およびPECAMに対する抗体で染色されたCSsの顕微鏡分析(それぞれiCC、HCAIC、およびHFのマーカーとして)は、内皮細胞ネットワークの形成を示した(図1、青)。CDの内側の壊死を完全に排除するために、カルセインAM/エチジウムホモジウム染色CDSの共焦点解析により、細胞生存率の空間的評価が行われた(データは示されていない)。しかし、生体構造分野における将来の発展は、生体内のヒト心臓に典型的な他の複雑な特徴をより良く再現し、現在既存のモデルでは利用できないことを認める必要がある。これらには、i)成人心筋細胞の典型的な収縮機能が含まれます。ii) 血流と圧力力;iii) パラクリンシグナリング;iv) 免疫応答は、これおよび他の体外心臓モデル6を改善するために重要となる。他のモデルは、健康な組織または疾患状態のいずれかの主要な特徴を再現することを目的としているので、この原稿に記載されているCSの生成と使用のためのプロトコルは、このアプローチを使用して網羅的ではないかもしれない特定の質問に対処する研究者を助けることを目的としています。例えば、CDの生成のための患者由来細胞の潜在的な使用は、現在、心血管研究のために一般的に利用可能なハイスループットアッセイを使用して利用できないパーソナライズされた医療のためのツールを提供するであろう。
結論として、心臓細胞を用いてヒト心臓微小環境をよりよく再現する簡単な方法を示した。心臓スフェロイドは、心臓細胞の単層培養と比較して、ヒト心臓に存在する細胞をよりよく再現する内皮細胞ネットワークを提示する。独自の特徴を考えると、彼らは心血管研究のためのインビトロテストのための高度なツールを表しています。患者由来の細胞を使用した将来の研究は、心血管疾患を予防し、より良く治療するためのパーソナライズされた医学と新しい治療法の選択肢を提供する可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
録画とビデオの編集のためのナット・ジョンストンに特別な感謝。
プーナム・シャルマは、ニューカッスル大学の支援を受け、UNIPRSとUNRS中央・教職員養学校(UNRSC5050)奨学金を受けています。カーミン異邦人は、UTSシードファンディング、成人幹細胞研究のためのシドニー補助金のカトリック大司教区、シドニー医学部財団心臓胸部外科研究助成金によって支援されました。
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A1933 | |
Donkey anti-mouse Secondary Antibodies | Jackson Immunological Research Labs, Inc. | 715-165-150 | Cyanine Cy3-conjugated secondary antibody |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1515 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | From Bovine Plasma |
Human cardiac fibroblasts (HCFs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 306AK-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human coronary artery endothelial cells (HCAECs) | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 300K-05a | 5×10^5 Cells (Adult), Medium & Subculture Reagents |
Human iPSC-derived cardiomyocytes (iCMs) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
HCF Growth medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 316-500 | |
Human MesoEndo Cell Growth Medium | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 212-500 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3224 | |
Maintenance Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Mouse Monoclonal anti-human CD31/PECAM | BD Pharmingen, San Diego, CA, USA | 566177 | |
NucBlue Live ReadyProbe Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | R37605 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Plating Medium (iCells) | Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. | R1057 | iCell Cardiomyocytes Kit, 01434 |
Rat Tail Collagen | Sigma-Aldrich | C3867 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Trypsin–EDTA, 0.25% | Gibco, Thermofisher Scientific | 25200072 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher Scientific | 15250061 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tissue culture flasks (T25) | Thermofisher Scientific | 156367 | |
96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-treated Microplates | Corning, New York, USA | 3603 | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, USA | HDP1385 |