טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש
Summary
פרוטוקול זה אינו פולשני גורם היפרגליקמיה ב zebrafish עד 8 שבועות. באמצעות פרוטוקול זה, מחקר מעמיק של ההשפעות השליליות של היפרגליקמיה יכול להתבצע.
Abstract
דגי זברה(דניו ריו)הם מודל מצוין לחקור את ההשפעות של היפרגליקמיה כרונית, סימן ההיכר של סוכרת מסוג II (T2DM). פרוטוקול טבילה חלופי זה הוא שיטה לא פולשנית, צעד חכם של גרימת היפרגליקמיה עד שמונה שבועות. דגי זברה בוגרים חשופים לסירוגין לסוכר (גלוקוז) ומים למשך 24 שעות כל אחד. דג הזברה מתחיל את הטיפול בתמיסת גלוקוז של 1% למשך שבועיים, לאחר מכן פתרון של 2% למשך שבועיים, ולבסוף פתרון של 3% במשך 4 השבועות הנותרים. בהשוואה לבקרות מטופלים במים (מתח) ומניטול (אוסמוטי), לזברה שטופלה בגלוקוז יש רמות סוכר גבוהות משמעותית בדם. הזברה שטופלה בגלוקוז מראה את רמות הסוכר בדם של פי 3 מאלה של פקדים, מה שמרמז כי לאחר ארבעה ושמונה שבועות ניתן להשיג היפרגליקמיה. היפרגליקמיה מתמשכת הייתה קשורה לחלבון חומצי גילאי מוגבר (GFAP) ולהגברת רמות הגורם הגרעיני קאפה B (NF-kB) ברשתית וירידה בתגובות פיזיולוגיות, כמו גם גירעונות קוגניטיביים המצביעים על כך שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לדגמן סיבוכים במחלות.
Introduction
זברהפיש(דניו rerio)הופכים במהירות מודל בעלי חיים בשימוש נרחב לחקור הן מחלה קוגניציה1. הקלות של מניפולציה גנטית ושקיפות עוברית בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים, הופכים אותם למועמדים עיקריים לחקור מחלות אנושיות עם בסיס גנטי ידוע. לדוגמה, דגי זברה שימשו לחקר תסמונת הולט-אורם, קרדיומיופתיות, מחלת כליות גלומרולוציסט, ניוון שרירים וסוכרת (DM) בין מחלות אחרות1. בנוסף, מודל זברה הוא אידיאלי בגלל גודלו הקטן של המין, קלות התחזוקה, פוריות גבוהה2,3.
הלבלב של דג הזברה דומה הן מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית ללבלב היונקים4. לכן, המאפיינים הייחודיים של גודל, פוריות גבוהה, ומבנים אנדוקריניים דומים להפוך זברהפיש מועמד מתאים ללימוד סיבוכים הקשורים DM. ב זברה, ישנן שתי שיטות ניסיוניות המשמשות כדי לגרום היפרגליקמיה ממושכת האופיינית DM: זרם של גלוקוז (דוגמנות סוג 2) והפסקת הפרשת אינסולין (דוגמנות סוג 1)5,6. באופן ניסיוני, כדי לעצור את הפרשת האינסולין, תאי β הלבלב יכולים להיהרס כימית באמצעות זריקות סטרפטוזוטוצין (STZ) או Alloxan. STZ שימש בהצלחה מכרסמים וזברה, וכתוצאה מכך סיבוכים הקשורים רטינופתיה7,8,9, ליקויים קוגניטיביים10, והתחדשות הגפיים11. עם זאת, ב zebrafish, β תאים להתחדש לאחר הטיפול, גרימת “זריקות המאיץ” של STZ להיות נחוץ כדי לשמור על תנאי סוכרת12. לחלופין, ניתן להסיר את הלבלב של דג הזברה6. שניהם הליכים פולשניים מאוד, בשל זריקות מרובות, וזמן התאוששות נרחב.
לעומת זאת, היפרגליקמיה יכולה להיגרם באופן לא פולשני באמצעות חשיפה לגלוקוז אקסוגני. בפרוטוקול זה, דגים שקועים בתמיסת גלוקוז מרוכזת מאוד במשך 24 שעות5,13 או ללא הרף במשך שבועיים14,15,16. גלוקוז אקסוגני נלקח transdermally, על ידי בליעה, ו /או על פני הזימים וכתוצאה מכך רמות סוכר גבוהות בדם. מכיוון שטכניקה לא פולשנית זו אינה מבצעת מניפולציה ישירה ברמות האינסולין, היא אינה יכולה לטעון שהיא מעוררת DM מסוג 2. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לבחון סיבוכים הנגרמים על ידי היפרגליקמיה, שהוא אחד הסימפטומים העיקריים של סוג 2 DM.
לאחרונה, מוטציית הזברה pdx1-/- פותחה על ידי מניפולציה של גן homeobox הלבלב והתריסריון 1, גן הקשור לגורם הגנטי של סוג 2 DM בבני אדם. באמצעות מוטציה זו, חוקרים הצליחו לשכפל הפרעה להתפתחות הלבלב, רמת סוכר גבוהה בדם, וללמוד רטינופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה17,18.
במאמר זה, אנו מתארים שיטת אינדוקציה היפרגליקמיה לא פולשנית המשתמשת בפרוטוקול טבילה לסירוגין. פרוטוקול זה שומר על תנאים היפרגליקמיים עד 8 שבועות עם סיבוכים הבאים שנצפו. בקצרה, דגי זברה בוגרים ממוקמים בתמיסת סוכר במשך 24 שעות ולאחר מכן פתרון מים במשך 24 שעות. בניגוד לטבילה מתמשכת בפתרונות גלוקוז חיצוניים, ימים מתחלפים בין סוכר למים מחקים את עלייתו ונפילתו של רמת הסוכר בדם בסוכרת. פרוטוקול גלוקוז לסירוגין מאפשר גם היפרגליקמיה להיות המושרה לפרקי זמן ארוכים יותר, כמו זברהפיש אינם מסוגלים לפצות על תנאי גלוקוז חיצוניים גבוהים. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים נתונים המראים כי היפרגליקמיה הנגרמת באמצעות פרוטוקול זה משנה כימיה רשתית ופיזיולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
סוכרת היא בעיה כלל ארצית. מחקרים מראים כי עד 2030, כ 400 מיליון אנשים יהיו צורה כלשהי של סוכרת. במודלים מכרסמים, סוג 2 DM נחקר באמצעות מניפולציה גנטית. בחולדות, חולדות שומן סוכרתי צוקר (ZDF), ואת חולדות שומן Otsuka לונג-אוונס Tokushima (OLETF), מספקים מידע נוסף על ההשפעות של סוג 2 DM10. בנוסף, דיאטות ע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להכיר VPC, CJR, ו MCP לפיתוח פרוטוקול זה. EMM קיבלה תמיכה כספית מהמכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים לתואר שני בתמיכת סטודנטים לביצוע מחקר זה. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס מלון הפקולטה של האוניברסיטה האמריקאית ומימון באמצעות המכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים (שניהם ל- VPC).
Materials
| Airline Tubing | petsmart | 5291863 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airpump | petsmart | 5094984 | This can be used in the tank to circulate air |
| Airstones | petsmart | 5149683 | This can be used in the tank to circulate air |
| D-glucose | Sigma | G8270-5KG | |
| D-mannitol | Acros Organics | AC125340050 | |
| Freestyle Lite Meter | Amazon | B01LMOMLTU | |
| Freestyle Lite Strips | Amazon | B074ZN3H2Z | |
| Net | petsmart | 5175115 | |
| Tanks | Amazon | B0002APZO4 |
References
- Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
- Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
- Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
- Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
- Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
- Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
- Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
- Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
- Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
- Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
- Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
- Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5′-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
- Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
- Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
- Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
- Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
- Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
- Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
- Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
- Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
- Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
- Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
- Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
- Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
- Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
- Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
- Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe’s Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
- Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
- Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
- Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).
