行動中および刺激に反応して、成人 ショウジョウバエ の脳全体を画像化するために特別に調整された方法を提示する。頭部は脳全体への光学的アクセスを可能にする位置にあり、ハエは脚と触角、プロボシスの先端を動かすことができるので、目は感覚刺激を受けることができる。
歩行などの継続的な行動の間に ショウジョウバエ の脳全体をイメージするために特別に開発された方法を提示する。頭部固定および解剖は、動作への影響を最小限に抑えるように最適化されています。これは、動きの障害を最小限に抑えるホルダーを使用することで、最初に達成されます。ハエの頭の後ろは、歩く、グルーミング、匂い、味わい、見るハエの能力を保持しながら、脳全体への光学アクセスを可能にする角度でこのホルダーに接着されています。頭部の後頭部は、光路の組織および頭部運動のアーティファクトを担う筋肉を除去するために解剖される。フライ脳は、その後、例えばカルシウムや電圧指標を使用して、歩行やグルーミングなどの特定の行動の間、および異なる刺激に応答して、脳活動を記録するために画像化することができます。かなりの練習を必要とする挑戦的な解剖が習得されると、この技術は、脳活動全体を行動および刺激応答に関連する豊富なデータセットを記録することを可能にする。
様々な技術を用いた脳活動のイメージングは、脳機能の理解を深めています。脳イメージング技術は重要な制限を有する:機能的磁気共鳴画像法(fMRI)は単一ニューロン分解能をはるかに下回る時空間分解能を提供するが、脳波(EEG)のような高速技術は脳への間接的かつ部分的なアクセスのみを可能にする1。げっ歯類のような十分に大きな動物モデルでは、頭部取付け顕微鏡を用いた蛍光活動センサ(例えばGCaMP)の記録は、動物がその環境内で移動している間に脳活動を観察することを可能にする2。それにもかかわらず、これらの技術は現在、脳のごく一部へのアクセスのみを与える。頭部固定動物はより包括的に画像化することができるが、カバレッジはまだ部分的である(例えば、皮質表面3)。ゼブラフィッシュの幼虫 、C.エレガンス 、 ショウジョウバエ などの小動物でのみ、脳全体が単一ニューロン4のレベルまたはそれに近いレベルで時間的および空間的解像度で画像化することができる。
D.メラノガスターは、長い間遺伝モデル生物5として使用されてきたので特に有望であり、強力な遺伝ツールが6開発されている。電子顕微鏡7に由来する新しい大規模解剖学的ネットワークによって補完され、ハエは大規模ネットワーク8で生成された複雑な脳のダイナミクスを研究するユニークな機会を提供することができる。キューティクルは透明ではなく、脳を画像化するために除去する必要がありますが、生体内機能イメージングは2002年9年の最初の研究以来ますます一般的な場所となっており、いくつかのプロトコルがすでに公開されています。しかし、これらの方法は、ハエヘッドをボディ10から分離するか、ハエの動きや刺激11、12、13、14、15に対する応答を厳しく制限するか、または脳の小さな部分を9、16、25、26、20、21、22、22、21、22、24にしか与え、または20、21、22、24である。これらの強力なアプローチを補完するために、我々は最近、様々な刺激に対する行動と応答の間に脳全体をイメージするための準備を開発しました28.
ここでは、この研究に基づいて、ハエが半自然主義的な行動(すなわち歩行およびグルーミング)を行い、感覚刺激に反応する間、脳全体を画像化するために特別に開発された方法を提示する。これは、後部側から脳全体へのアクセスを与え、触角とプロボシスをそのまま残し、ハエが足を歩いて歩くことを可能にするように設計された観測ホルダーを使用することによって達成される(例えば、エアクッションボールで)。頭部の後部を解剖するためのステップは速度、再現性のために改良され、そしてハエの生存性および移動性への影響を最小にする。
ショウジョウバエ は、複雑な行動の間に脳全体を画像化することができる珍しい成虫動物の一つです。ここでは、ハエを準備し、進行中の脳活動全体を画像化するために脳全体を露出する方法を提示する。いくつかの重要な点に注意する必要があります。
D.メラノガスターのような小さな動物を解剖することは困難です。この方法は、このようにそれを習得するために多くの練習と忍耐を必要とします。しかし、トレーニング後、手順は30分未満で、再現性の高い結果を生成します。
我々が提示した方法には、追加の制限があります。まず、その自然な位置からハエの頭を傾けると、結合組織、神経または筋肉に損傷を与える可能性のある首を伸ばすことができます。第2に、腹側食道領域(SEZ)は光学的にアクセス可能であるが、半透明食道より下にあり、この領域の強度と解像度が低下する。最後に、ホルダーはほとんどの方向に手の届かないところにありますが、ハエはまだ時々その存在を認識し、脱出しようとするそれを押します。
これらの制限にもかかわらず、行動中の脳イメージング全体から得られた包括的なデータと刺激への応答は、動物が複雑で自然主義的な環境と相互作用し、ナビゲートするときに、ネットワーク全体のレベルで脳機能を解読することを可能にします。
The authors have nothing to disclose.
ハイジ・ミラー=モマーズカンプの技術的な助け、アイヴス・メリッサ・グアティボンザ・アレバロの原稿に対する有益なコメントに感謝します。プロトコルの初期バージョンはラルフグリーンスパンの研究室で開発されました。この研究は、ドイツ研究財団(DFG)、特にIGKへの助成金FOR2705(TP3)、およびサイモンズ財団(アイモン – 414701)とカブリ脳と心研究所(認可番号#2017-954)によって支援されました。
#5 forceps | FST by DUMONT | 11252-30 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 11 cm long |
#55 forceps | FST by DUMONT | 11255-20 | straight tip 0.05 x 0.02 mm, Inox, 11 cm long |
30x oculars | yegren | WF30-9-30-H | WF30X/9 High Eye-point Eyepiece Wide Field View Ocular Optical Lens for Stereo Microscope or Biological Microscope 30X, 30mm without Reticle |
AHOME/UV flashlight | Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd | B07V2W9543 (ASIN) | 365 nm |
Fotoplast Gel/UV Glue | Dreve Otoplastik GmbH | 44791 | GHS07, GHS08 |
Gloss Finish Transparent Tape | 3M Scotch | ||
KIMTECH Science/Precision wipes | Kimberly-Clark Professional | 7552 | 11 x 21 cm |
KL 1500 LCD/Microscope light | Schott | ||
Leica MS5 Microscope | Leica | WF30X/9 | |
Nail Lacqueur | Opi Products Inc., N. Hollywood | 6306585338 | black |
Saline: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl sucrose threalose | Sigma Aldrich | ||
Scalpel | Werner Dorsch GmbH | 78 621; B07SXCXWFS (ASIN) | soft handle |
Vacuum grease | Dow corning | 0020080 /100 gr | Moly Kote 111 Compound Grease Grease Valve Stamp 100 g |