इम्यूनोफ्लोरेसेंस और न्यूरल ट्रेसिंग के साथ चूहा कपाल ड्यूरा मेटर के कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड इम्यूनोरेएक्टिव इनरवेशन की कल्पना करना
Summary
यहां हम क्रमशः सीजीआरपी और फालोइडिन के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लोरोसेंट हिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर में कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) के स्थानिक सहसंबंध की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, इन तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति एक फ्लोरोसेंट तंत्रिका ट्रेसर के साथ पता लगाया प्रतिगामी था।
Abstract
इस अध्ययन का उद्देश्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस, त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण और प्रतिगामी अनुरेखण तकनीक का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर के कैल्शियम युक्त पेप्टाइड (सीजीआरपी)-इम्यूनोरेएक्टिव संवेदी तंत्रिका फाइबर के वितरण और उत्पत्ति की जांच करना था। यहां, तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं को क्रमशः सीजीआरपी और फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और हिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों का उपयोग करके दाग दिया गया था। ड्यूरल सीजीआरपी-इम्यूरएक्टिव तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं के स्थानिक सहसंबंध को 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इस बीच, सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का पता फ्लोरोगोल्ड (एफजी) के साथ तंत्रिका अनुरेखण तकनीक द्वारा कपाल ड्यूरा मेटर में ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और ग्रीवा (सी) डोरसल रूट गैंगलिया (डीआरजी) के लिए मध्य मेनिंगियल धमनी (एमएमए) के आसपास के क्षेत्र से लगाया गया था। इसके अलावा टीजी और डीआरजी में एफजी लेबल वाले न्यूरॉन्स की रासायनिक विशेषताओं की भी डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का इस्तेमाल करते हुए सीजीआरपी के साथ मिलकर जांच की गई । पारदर्शी पूरे माउंट नमूने और 3 डी पुनर्निर्माण का लाभ उठाते हुए, यह दिखाया गया कि सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फालोइडिन-लेबल वाले धमनियों को एक साथ चलाते हैं या अलग से 3 डी दृश्य में एक ड्यूरल न्यूरोवैस्कुलर नेटवर्क बनाते हैं, जबकि एफजी लेबल वाले न्यूरॉन्स टीजी की नेत्र, मैक्सिलरी और मंडीबुलर शाखाओं में पाए गए, साथ ही सी 2-3 डीआरजी इप्लीटरल को ट्रेसर एप्लीकेशन के पक्ष में पाया गया जिसमें कुछ एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव एक्सप्रेशन के साथ प्रस्तुत किए गए । इन दृष्टिकोणों के साथ, हमने कपाल ड्यूरा मेटर में रक्त वाहिकाओं के आसपास सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की वितरणात्मक विशेषताओं के साथ-साथ टीजी और डीआरजी से इन तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का प्रदर्शन किया। कार्यप्रणाली के नजरिए से, यह शारीरिक या रोग स्थिति के तहत कपाल ड्यूरा मेटर की जटिल न्यूरोवैस्कुलर संरचना को समझने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान कर सकता है।
Introduction
कपाल ड्यूरा मेटर मस्तिष्क की रक्षा के लिए मेनिंग्स की सबसे बाहरी परत है और इसमें बहुतायत से रक्त वाहिकाएं और विभिन्न प्रकार के तंत्रिका तंतुओं होते हैं1,2. कई अध्ययनों से पता चला है कि संवेदनशील कपाल ड्यूरा मेटर सिर दर्द की घटना के लिए अग्रणी कारक हो सकता है, जिसमें असामान्य वासोडिलेशन और इनरवेशन3,4,5शामिल हैं। इस प्रकार, कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना का ज्ञान सिरदर्द के रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से माइग्रेन के लिए।
यद्यपि ड्यूरा इनरवेशन का पहले पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ अध्ययन किया गया है, लेकिन कपाल ड्यूरा मेटर में तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं के स्थानिक सहसंबंध का कम अध्ययन किया गया6,7,8,9। अधिक विस्तार से ड्यूरल न्यूरोवैस्कुलर संरचना को प्रकट करने के लिए, कैल्शियम जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) और फालोइडिन को क्रमशः इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लोरोसेंट हिस्टोकेमिस्ट्री10के साथ पूरे माउंट कपाल ड्यूरा मेटर में ड्यूरल तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं को धुंधला करने के लिए मार्कर के रूप में चुना गया था । न्यूरोवैस्कुलर संरचना के त्रि-आयामी (3 डी) दृश्य प्राप्त करने के लिए यह एक इष्टतम विकल्प हो सकता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोगोल्ड (एफजी) को सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति निर्धारित करने के लिए कपाल ड्यूरा मेटर में मध्य मेनिंगियल धमनी (एमएमए) के आसपास के क्षेत्र पर लागू किया गया था, और ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और सर्वाइकल (सी) पृष्ठीय रूट गंगलिया (DRGs) का पता लगाया गया था, जबकि एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स को इम्यूनोफ्लोरेंस का उपयोग करके सीजीआरपी के साथ एक साथ जांच की गई थी।
इस अध्ययन का उद्देश्य सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव इनरवेशन और इसकी उत्पत्ति के लिए कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना की जांच के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करना था। पारदर्शी पूरे माउंट ड्यूरा मेटर का लाभ उठाकर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, प्रतिगामी ट्रेसिंग, कॉन्फोकल तकनीक और 3 डी पुनर्निर्माण के संयोजन से, हमें कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना का एक उपन्यास 3 डी दृश्य पेश करने की उम्मीद थी। इन पद्धतिगत दृष्टिकोणों को विभिन्न सिरदर्दों के रोगजनन की खोज के लिए आगे परोसा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने इम्यूनोफ्लोरेसेंस, 3 डी पुनर्निर्माण और सीजीआरपी एंटीबॉडी और एफजी तंत्रिका ट्रेसर के साथ तंत्रिका अनुरेखण दृष्टिकोण का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर में सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (परियोजना कोड संख्या 2019YFC1709103; संख्या 2018YFC1707804) और नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (प्रोजेक्ट कोड नंबर 81774211; नंबर 81774432; नंबर 81801561) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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