Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.
Abstract
O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.
Introduction
A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a enxaqueca.
Embora a innervação dura tenha sido previamente estudada com a imunohistoquímica convencional, a correlação espacial das fibras nervosas e vasos sanguíneos na duracolia craniana foram menos estudadas6,7,8,9. Para revelar a estrutura neurovascular dural com mais detalhes, peptídeos relacionados a genes de calcitonina (CGRP) e faloideína foram selecionados como marcadores para, respectivamente, coloração das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura craniana de todo o monte com imunofluorescência e histoquímica fluorescente10. Pode ser uma escolha ideal para obter uma visão tridimensional (3D) da estrutura neurovascular. Além disso, fluorogold (FG) foi aplicada na área em torno da artéria meningeal média (MMA) na dura-dura craniana para determinar a origem das fibras nervosas imunorreativas CGRP, e rastreada à gânglio trigeminal (TG) e gânglios de raiz dorsal (DRGs) cervicais (DRGs), enquanto os neurônios rotulados pelo FG foram examinados juntamente com CGRP usando imunofluorescência.
O objetivo deste estudo foi fornecer uma ferramenta eficaz para a investigação da estrutura neurovascular na dura mater craniana para a inervação CGRP-imunoreactive e sua origem. Aproveitando a dura-dura-montagem transparente e combinando a imunofluorescência, o rastreamento retrógrado, as técnicas confocal e a reconstrução 3D, esperamos apresentar uma nova visão 3D da estrutura neurovascular na dura-duracaca craniana. Essas abordagens metodológicas podem ser ainda mais servidas para explorar a patogênese de diferentes dores de cabeça.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.
Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca4,17</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo projeto do Programa Nacional de P&D da China (Project Code nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Código de Projeto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).
Materials
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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