Summary

Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L’attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall’attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L’analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.

Introduction

Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l’applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale1.

Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che sono coinvolti nell’apprendimento e nella memoria, sostituendo così i neuroni persi o danneggiati. Sfortunatamente, questi NSC sono presenti in quantità limitate e questa neurogenesi limitata diminuisce rapidamente durante lo sviluppo giovanile2. Pertanto, altre fonti di cellule neurali devono essere considerate in un obiettivo di terapia cellulare.

Le malattie neurologiche degenerative sono difficili da curare utilizzando approcci farmacologici standard. Le nuove strategie terapeutiche per abbracciare molti disturbi neurologici imedicabili si basano su terapie di sostituzione cellulare del tessuto danneggiato e ferito. Il trapianto NSC potrebbe sostituire le cellule danneggiate e fornire effetti benefici. Altre fonti per la sostituzione delle cellule neurali includono le cellule staminali embrionali umane (ESC), che derivano dalla massa cellulare interna delle blastocsti dei mammiferi3, così come gli iPSC4, che hanno un’ampia capacità di autorinnovizzo come gli ESC e sono in grado di differenziarsi in vari lignaggi cellulari. Gli NSC possono anche essere generati dalla riprogrammazione diretta da fibroblasti umani evitando lo stato pluripotente5.

La terapia sostitutiva cellulare è ancora un problema impegnativo. Sebbene ESC, fetale o iPS possano essere una fonte per la generazione di cellule neuronali per il trattamento di molte malattie neurologiche incurabili, la sostituzione automatica delle cellule dei PC adulti adulti dei tessuti danneggiati è un’alternativa migliore che aggira i problemi immunologici, etici e di sicurezza.

L’attivazione di proteine umane legate alla GPI mediante collegamento incrociato anticorpale tramite fosforilazione di PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN avvia una dedifferentiazione delle cellule progenitrici del sangue e la generazione di cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PDC)6. Queste cellule si differenziano in vitro verso le cellule neuronali come confermato mediante analisi di radiologia, immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).

In questo lavoro descriviamo la generazione senza OGM di BD-PSC e la loro riuscita ri-differenziazione in cellule con fenotipo neuronale.

Protocol

Le approvazioni etico sono state ottenute durante l’esecuzione degli esperimenti. 1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC) Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali. Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard. Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utiliz…

Representative Results

I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano. Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentia…

Discussion

Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull’attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all’espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi strati<sup cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dedicato alla memoria del Dr. Rainer Saffrich.

Gli autori sono particolarmente grati a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez per aver eseguito esperimenti e analisi dei mercati emergenti presso il Laboratorio di Neurobiologia Comparata, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Università di Valencia, CIBERNED, Valencia, Spagna, che è stato supportato da finanziamenti per la ricerca del Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Il resto di questo lavoro è stato supportato da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
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Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

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