Summary

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

Published: July 08, 2020
doi:

Summary

Gelişimin erken aşamalarında yumurtalık foliküllerinden büyüyen yumurtaların izolasyonuna yönelik prosedürlerin yanı sıra büyümeyi ve farklılaşmayı tam olarak büyümüş aşamaya kadar desteklendirebilecek bir in vitro kültür sisteminin kurulumunu anlatıyoruz.

Abstract

Olgun, döllenebilir yumurtaların sınırlı rezervi, memelilerde yardımcı üremenin başarısı için önemli bir engel teşkil eder. Üreme ömrü boyunca yumurtalıkolgun ve yumurtlayan yumurtaların sadece %1’inin yumurtalıkların sadece %1’inde yumurtalık rezervinin yumurtalık dışı foliküllerin artan popülasyonuna olan sömürüsünü artırmak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık ta seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin vemiştir. Ancak, yumurtalık rezervinin büyük potansiyeli hala büyük ölçüde sömürülmemaktadır. Örneğin, belirli gelişimsel evrelerde yumurtaların in vitro kültürünü desteklemek için bazı girişimlerde bulunulmuş, ancak verimli ve güvenilir protokoller henüz geliştirilmemiştir. Burada, sığır erken antral foliküllerinden tam olarak yetiştirilen evreye kadar toplanan in vitro büyüyen oositlerin geliştirilmesi için tanımlanan, ilgili foliküler evrenin fizyolojik koşullarını yeniden üreten bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Hormonlar ve fosfodiesteraz 3 inhibitörü bir arada zamansız meiyotik devamı önlemek ve oosit farklılaşması rehberlik etmek için kullanılmıştır.

Introduction

Üreme ömrü boyunca, bir yumurtalık olgun mevcut yumurtaların sadece minimal bir kısmını, yumurtlama üzerine fallop tüpleri serbest bırakılır, ve döllenmiş olmak ve uygun bir embriyo haline geliştirmek için kullanılabilir1. Öte yandan, bir yumurtalık içinde oositlerin çoğu atrezi geçmesi ve yumurtalık asla. In vitro embriyo üretimi (IVP) teknolojileri yumurtalıkrezervi2,3sömürü artırmak için çalıştılar. Şimdiye kadar, bu tür teknolojiler doğurganlık koruma müdahaleleri, hayvancılık seçim programları ve nesli tükenmekte olan türlerin korunması izin verdi. Yine de, çoğu protokol temelde antral yumurtalık folikül içinde büyüme aşaması tamamlamış yumurta kullanın, ve dolayısıyla tam büyümüş yumurta olarak adlandırılır. IVP teknolojilerinin yaygın olarak kullanıldığı sığırlarda, tam olarak yetiştirilen yumurtalar yaklaşık 120 μm’lik bir çapa ulaşır ve çapı 2 ila 8 mm arasında değişen foliküllerden toplanır (orta antral foliküller)1. Foliküllerden izolasyon üzerine, bu tür yumurtalar in vitro olgunlaşmış ve döllenmiş. Zigotlar daha sonra blastosist evresine kadar kültürlenir ve ya alıcıya aktarılır ya da kriyokorunmuş olur. Sığır, yanı sıra diğer birçok tür, IVP tarafından sunulan potansiyele rağmen, başına üretilen in vitro embriyo sayısı büyük ölçüde son 40 yıldır artmadı. Bu kısmen alınabilir ve standart IVP teknikleri 4 tabi belirli bir zamanda bir yumurtalık doldurmak tam olarak yetiştirilen yumurta sınırlı sayıda nedeniyle4,5,6.

Erken antral foliküller içinde kapalı oositler, yani, çapı 2 mm’den az olan bu foliküller, doğurganlık koruma programlarında kullanılmak üzere potansiyel bir kaynak temsil7 , bir yumurtalık kabaca orta antral daha 10 kat daha erken antral foliküller içerir8. Ancak, bu oositler hala büyüme aşamasında ve henüz tam olarak yetiştirilen aşama9ulaşmadı . Bu nedenle, hala transkripsiyon elverişsal aktif, daha sonraki gelişimsel adımlar için saklanacak mRNA’lar üreten, ve henüz kendiliğinden devam etme ve mayoz tamamlama yeteneği ile oositler vermek için gerekli tüm farklılaşma sürecinden geçmedi bir kez foliküler bölmesi izole10,11. Bu nedenle, doğrudan standart in vitro olgunlaşma (IVM) protokollerine sunulamaz, ancak büyüme aşamasını tamamlamak ve düzgün bir şekilde ayırt etmek için izin verecek ek bir kültür dönemi gerektirir.

Folikül erken antral evresinden orta antral evreye geliştiğinde sığırlarda meydana gelen büyüme den tam olarak yetiştirilen evreye geçiş, yumurta gelişimi sırasında kritik adımlardan biridir. Sığır, çeşitli çalışmalarda bu olayları in vitro2,12,13,,14,15,16,17,18,19olarak özetlemeye çalıştı. Ancak, bugüne kadar hiçbir güvenilir protokoller geliştirilmiştir ve sadece sınırlı başarı bildirilmiştir. Önceki çalışmalara göre20, Bu büyüyen yumurta homojen bir popülasyon oluşturmaktadır. Transkripsiyonel aktif olmasının yanı sıra, onların kromatin germinal vezikül dağılır (GV), GV02,adlı bir yapılandırma,21. Tersine, orta antral foliküllerden elde edilen tam büyümüş oositlerin popülasyonu daha heterojendir, kromatin sıkıştırmanın çeşitli dereceleri (GV1, GV2 ve GV3) ile yansıtılan birdurumdur 20. Bunlar arasında, önceki veriler GV2 ve GV3 oositler genel olarak daha kaliteli ve daha yüksek embriyonik gelişimsel yeterlilik20,21,,22,23,24ile karakterize olduğunu göstermiştir.

Yukarıdaki gözlemlerden yola çıkarak, burada, erken antral foliküllerden kümülüs-oosit kompleksleri (COC) olarak izole edilmiş yumurtaların farklılaşmasını sağlayan 5 günlük bir kültür yumurtası sistemini (L-IVCO) açıklıyoruz. Bu kültür stratejisi laboratuarımızda yürütülen 10 yıllık uzun çalışmalardan gelişti ve daha önce geliştirilen 24-48 saat in vitro oosit kültürü (IVCO)2,prematürasyon sistemleri23,25 ve oosit kültürü sırasında çinko takviyesi üzerine zemin kökleri . Folikül uyarıcı hormon (FSH) ve fosfodiesteraz-3 (PDE3) inhibitörü kombinasyonu, kümülüs-oositiletişiminigeliştirebilen 2 , zamansız meiyotik devamı önlemek2, ve destek oosit büyüme2 kullanıldı.

Protocol

Yumurtalıklar yerel mezbahada (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, İtalya) bulunan 4 ila 8 yaşındaki Holstein süt ineklerinden toplanmıştır. 1. Medya hazırlığı NOT: Tüm ortamlar kullanımdan en az dört saat önce hazırlanmalıdır. Sodyum bikarbonat tamponlu ortam 38,5 °C ve %5 CO2 hava, maksimum nem de kuluçkaya yatırılır. HEPES-tamponlu ortam termostatik fırında 38.5 °C’de muhafaza edilir. Yumurtaları…

Representative Results

L-IVCO sonunda, COCs brüt morfolojisi değişti ve 4 sınıf kümülüs hücrelerinin görünümüne göre tespit edildi, Şekil 2’degösterildiği gibi . SağlıklıCOC’ların 11,,26,,27, sınıf 1, 2 ve 3’ü seçmek için yaygın olarak kabul edilen morfolojik kriterlere göre sağlıklı değerlendirilirken, oositleri çevreleyen kümülüs hücrelerinin tam tabakalarının yokluğu gibi açık …

Discussion

Burada, yumurtaların canlılığını destekleyerek ve meyozis inmesini engelleyerek 5 gün boyunca yumurta gelişimini destekleyen yumurtaların büyümesini sağlayan bir kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu ikinci yönü sürekli büyüme ve farklılaşma meiyotik ve embriyonikgelişimselyetkinlik2,20ile oosit vermek için gerekli izin vermek için en önemli öneme sahiptir , aksi takdirde meiyotik bölünme erken bir devamı tarafından bloke olacaktır.</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 ve UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materials

4-well dishes Nunclon 179830
96-well dish Becton Dickinson Biosciences 356649 BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) Sigma A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Sigma A3311
Cell culture water Sigma W3500
Cilostamide Sigma C7971
Cysteamine Sigma M9768
Digital camera Nikon Corp Camera DS-5M
Disodium phosphate Sigma S5136
Estradiol Sigma E2758
Glutamax Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061
Gonal F Merck Serono
Heparin Sigma H3149
Hepes Sigma H3784
Vacuum pump Cook-IVF
Incubator Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma K1377
Medium 199 Sigma M3769 Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199 Sigma M2520 Powder for M199-D
Microscope Nikon Corp Nikon Diaphot
Microscope Nikon Corp Eclipse E 600
Monopotassium phosphate Sigma P5655
Paraformaldehyde Sigma 158127
Penicilin Sigma P3032
Phenol Red Sigma P5530
Polyvinyl alcohol Sigma P8137
Polyvinylpyrrolidone Sigma P5288 360k molecular weight
Potassium chloride Sigma P5405
Progesterone Sigma P8783
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium choride Sigma P5886
Sodium pyruvate Sigma P4562
Streptomycin Sigma S9137
Testosterone Sigma 86500
Triton X Sigma T9284
Vectashield with DAPI Vector Laboratories H1200
Water Sigma W3500
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Z0251

References

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

Play Video

Cite This Article
Barros, R. G., Lodde, V., Franciosi, F., Luciano, A. M. In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle. J. Vis. Exp. (161), e61625, doi:10.3791/61625 (2020).

View Video