Summary

In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

Published: July 08, 2020
doi:

Summary

We beschrijven de procedures voor isolatie van groeiende eicellen uit eierstokzakjes in een vroeg stadium van ontwikkeling, evenals de opzet van een in vitro cultuursysteem dat de groei en differentiatie tot aan de volgroeide fase kan ondersteunen.

Abstract

De beperkte reserve van volwassen, bevruchtbare eicellen vormt een belangrijke barrière voor het succes van geassisteerde voortplanting bij zoogdieren. Gezien het feit dat tijdens de reproductieve levensduur slechts ongeveer 1% van de eicellen in een eierstok volwassen en ovuleren, verschillende technieken zijn ontwikkeld om de exploitatie van de eierstokreserve te verhogen tot de groeiende bevolking van niet-ovulatory follikels. Dergelijke technologieën hebben toegestaan interventies van vruchtbaarheid behoud, selectie programma’s in vee, en het behoud van bedreigde soorten. Het enorme potentieel van de eierstokreserve is echter nog grotendeels onbenut. Bij koeien zijn bijvoorbeeld pogingen ondernomen om de in vitrocultuur van eicellen in specifieke ontwikkelingsstadia te ondersteunen, maar efficiënte en betrouwbare protocollen zijn nog niet ontwikkeld. Hier beschrijven we een kweeksysteem dat de fysiologische omstandigheden van het overeenkomstige folliculaire stadium reproduceert, gedefinieerd om in vitro groeiende eicellen te ontwikkelen die afkomstig zijn van runderige antrale follikels tot het volgroeide stadium, wat overeenkomt met de gemiddelde antral follikel in vivo. Een combinatie van hormonen en een fosfodiesterase 3 remmer werd gebruikt om voortijdige meiotische hervatting te voorkomen en om oocyte’s differentiatie te begeleiden.

Introduction

Tijdens de reproductieve levensduur, slechts een minimale fractie van de eicellen die aanwezig zijn in een eierstok volwassen, worden vrijgegeven in de eileiders bij de ovulatie, en zijn beschikbaar voor bevrucht en ontwikkelen tot een levensvatbare embryo1. Aan de andere kant ondergaan de meeste eicellen in een eierstok atresie en worden ze nooit ovulated. In vitro embryoproductie (IVP) technologieën hebben geprobeerd de exploitatie van de eierstokreserve2,3teverhogen . Tot nu toe hebben dergelijke technologieën toegestaan interventies van vruchtbaarheid behoud, selectie programma’s in vee, en het behoud van bedreigde soorten. Niettemin, de meeste protocollen gebruiken eicellen die in principe hebben voltooid de groeifase binnen de antral eierstok follikel, en dus worden aangeduid als volgroeide eicellen. Bij runderen, waar IVP-technologieën op grote schaal worden gebruikt, bereiken volgroeide eicellen een uiteindelijke diameter van ongeveer 120 μm en worden ze verzameld uit follikels met een diameter van 2 tot 8 mm (middelgrote antralzakjes)1. Bij isolatie van de follikels worden dergelijke eicellen in vitro gerijpt en bevrucht. De zygotes worden vervolgens gekweekt tot de blastocyst fase en ofwel overgebracht naar een ontvanger of cryopreserved. Bij runderen, maar ook bij vele andere soorten, ondanks het potentieel van IVP, is het aantal in vitro geproduceerde embryo’s per koe de afgelopen 40 jaar niet grotendeels verbeterd. Dit is deels te wijten aan het beperkte aantal volgroeide eicellen die een eierstok bevolken op een bepaald moment dat kan worden opgehaald en onderworpen aan standaard IVP-technieken4,5,6.

De eicellen ingesloten in vroege antral follikels, dat wil zeggen, die follikels die minder dan 2 mm in diameter, vertegenwoordigen een potentiële bron te worden gebruikt in de vruchtbaarheid behoud programma’s7 , als een eierstok bevat ruwweg 10 keer meer vroege antrale follikels dan medium antral8. Deze eicellen bevinden zich echter nog in de groeifase en hebben nog geen volgroeide fase9bereikt . Als zodanig zijn ze nog steeds transcriptie actief, produceren mRNAs die zullen worden opgeslagen voor latere ontwikkelingsstappen, en hebben nog niet ondergaan alle differentiatie proces dat nodig is om de eicellen te verlenen met de mogelijkheid van spontaan hervatten en het invullen van meiose Ik eenmaal geïsoleerd uit de folliculaire compartiment10,11. Daarom kunnen ze niet rechtstreeks worden onderworpen aan standaard in vitro maturatie (IVM) protocollen, maar ze vereisen een extra periode van cultuur die hen in staat zou stellen om de groeifase te voltooien en goed te differentiëren.

De overgang van het groeiende naar het volgroeide stadium, dat bij runderen optreedt wanneer de follikel zich ontwikkelt van de vroege antraal naar de gemiddelde antrarale fase, is een van de kritieke stappen tijdens de ontwikkeling van de eicel. Bij runderen probeerden verschillende studies deze voorvallen samen te vatten in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Tot op heden zijn er echter geen betrouwbare protocollen ontwikkeld en is slechts beperkt succes gemeld. Volgens eerdere studies20, deze groeiende eicellen vormen een homogene populatie. Naast transcriptie actief, wordt hun chromatine verspreid in de kiersyscle (GV), in een configuratie die GV02,21heet . Omgekeerd is de populatie van volgroeide eicellen verkregen uit middelgrote antralzakjes heterogeener, een aandoening die wordt weerspiegeld door de verschillende graden van chromatineverdichting (GV1, GV2 en GV3) die kunnen worden waargenomen20. Uit eerdere gegevens is gebleken dat GV2 en GV3-eicellen over het algemeen worden gekenmerkt door een betere kwaliteit en een hogere embryonale ontwikkelingscompetentie20,21,22,23,24.

Uitgaande van de bovenstaande waarnemingen beschrijven we hier een 5-dagen lang kweeksysteem van eicellen (L-IVCO) dat de differentiatie van eicyten geïsoleerd als cumulus-eicellencomplexen (COC’s) van vroege mierenfollillen mogelijk maakt. Deze cultuurstrategie is geëvolueerd van 10 jaar lange studies uitgevoerd in ons lab en wortels zijn grond op de eerder ontwikkelde 24-48 uur in vitro eicelcultuur (IVCO)2, voorverzadigingssystemen23,25 en zink suppletie tijdens de eicelcultuur . Een combinatie van follikel stimulerend hormoon (FSH) en een fosfodiesterase-3 (PDE3) remmer, in staat om cumulus-eicelcommunicatie te verbeteren2,voortijdige meiotische hervatting2te voorkomen en oocytengroei2 te ondersteunen.

Protocol

Eierstokken werden verzameld van 4 tot 8 jaar oude Holstein melkkoeien teruggewonnen in het lokale slachthuis (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italië). 1. Voorbereiding van de media LET OP: Alle media moeten ten minste vier uur voor gebruik worden voorbereid. Natriumbicarbonaat gebufferde media worden geïncubeerd bij 38,5 °C en 5% CO2 in de lucht, maximale vochtigheid. HEPES-gebufferde media worden gehandhaafd op 38,5 °C in thermo…

Representative Results

Aan het einde van de L-IVCO veranderde de grove morfologie van de COC’s en werden 4 klassen geïdentificeerd op basis van het uiterlijk van de cumuluscellen, zoals weergegeven in figuur 2. Op basis van de morfologische criteria die gewoonlijk werden vastgesteld om gezonde COC’s11,26,27, de klasse 1, 2 en 3 te selecteren, werden de klasse 4, die duidelijke tekenen van degeneratie vertoonde, zoals het…

Discussion

Hier beschrijven we een cultuursysteem voor het kweken van eicellen dat de ontwikkeling van eicel bevordert gedurende 5 dagen door hun levensvatbaarheid te ondersteunen en meiotische hervatting te voorkomen. Dit laatste aspect is van het grootste belang om de verdere groei en differentiatie mogelijk te maken die nodig zijn om de eicel te voorzien van meiotische en embryonale ontwikkelingscompetentie2,20, die anders zou worden geblokkeerd door een voortijdige herv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 en UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materials

4-well dishes Nunclon 179830
96-well dish Becton Dickinson Biosciences 356649 BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) Sigma A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Sigma A3311
Cell culture water Sigma W3500
Cilostamide Sigma C7971
Cysteamine Sigma M9768
Digital camera Nikon Corp Camera DS-5M
Disodium phosphate Sigma S5136
Estradiol Sigma E2758
Glutamax Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061
Gonal F Merck Serono
Heparin Sigma H3149
Hepes Sigma H3784
Vacuum pump Cook-IVF
Incubator Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma K1377
Medium 199 Sigma M3769 Powder for hepes-buffered TCM199
Medium 199 Sigma M2520 Powder for M199-D
Microscope Nikon Corp Nikon Diaphot
Microscope Nikon Corp Eclipse E 600
Monopotassium phosphate Sigma P5655
Paraformaldehyde Sigma 158127
Penicilin Sigma P3032
Phenol Red Sigma P5530
Polyvinyl alcohol Sigma P8137
Polyvinylpyrrolidone Sigma P5288 360k molecular weight
Potassium chloride Sigma P5405
Progesterone Sigma P8783
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium choride Sigma P5886
Sodium pyruvate Sigma P4562
Streptomycin Sigma S9137
Testosterone Sigma 86500
Triton X Sigma T9284
Vectashield with DAPI Vector Laboratories H1200
Water Sigma W3500
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Z0251

References

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

Play Video

Cite This Article
Barros, R. G., Lodde, V., Franciosi, F., Luciano, A. M. In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle. J. Vis. Exp. (161), e61625, doi:10.3791/61625 (2020).

View Video