Der in dieser Studie beschriebene Ex-vivo-Assay mit Darmhomogenat-Extrakten und Immunfluoreszenzfärbung stellt eine neuartige Methode dar, um die Hypahypomorphogenese von Candida albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Umweltsignale zu untersuchen, die den morphogenetischen Übergang im Darm regulieren.
Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt (GI) wird durch verschiedene Umweltsignale streng kontrolliert und spielt eine wichtige Rolle bei der Verbreitung und Pathogenese dieses opportunistischen Pilzerregers. Allerdings sind Methoden zur Visualisierung von Pilzhyphen im GI-Trakt in vivo eine Herausforderung, die das Verständnis von Umweltsignalen bei der Steuerung dieses Morphogenese-Prozesses einschränkt. Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine neuartige ex vivo Methode zur Visualisierung der Hyphalmorphogenese in Darmhomogenatextrakten. Anhand eines Ex-vivo-Assays zeigt diese Studie, dass cecal-Gehalte von antibiotikabehandelten Mäusen, aber nicht von unbehandelten Kontrollmäusen, C. albicans Hyphalmorphogenese im Darmgehalt fördern. Darüber hinaus reguliert das Hinzufügen spezifischer Gruppen von Darmmetaboliten zu den Cecal-Inhalten von antibiotikabehandelten Mäusen die Hyphenmorphogenese ex vivo. Zusammengenommen stellt dieses Protokoll eine neuartige Methode dar, um die Umweltsignale zu identifizieren und zu untersuchen, die die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt steuern.
Candida albicans ist ein opportunistischer, polymorpher Pilzerreger, der normalerweise commensal ist, aber eine morphologische Veränderung in eine virulente Form durchmachen kann, die lebensbedrohliche Infektionen bei immungeschwächten Individuen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13verursachen kann. C. albicans ist eine der Hauptursachen für systemische nosokomiale Infektionen, mit einer Sterblichkeitsrate von 40-u201260% auch bei antimykogaler Behandlung2,14,15. Obwohl C. albicans in verschiedenen Wirtsnischen einschließlich des weiblichen Fortpflanzungssystems16,17, die Mundhöhle von gesunden Personen18 und der Magen-Darm-Trakt19,20, die Mehrheit der systemischen Infektionen stammen aus dem GI-Trakt und darüber hinaus, die Quelle der systemischen Infektion wird oft bestätigt, um die GI-Trakt21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. Albicans Pathogenität im GI-Trakt wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst; Ein wesentliches Merkmal, das für die Virulenz notwendig ist, ist jedoch der Übergang von einer Hefezellmorphologie zu einer virulenten Hypothekzellmorphologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. Albicans Anhaftung und Verbreitung aus dem GI-Trakt während der Infektion ist stark mit seiner Fähigkeit verbunden, von einer kommensalen Hefe in virulenten Hyphen zu übergehen, so dass die Pilze invasive Krankheitverursachen 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Eine Vielzahl von Faktoren im Darm, einschließlich n-Acetylglucosamin, regulieren Hyphalbildung durch C. albicans. Daher ist es entscheidend, die Wissenslücke über die Hyphalmorphogenese dieses Pilzerregers im GI-Trakt54,55,56zu verringern. Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass verschiedene Darmmetaboliten die Hyphalmorphogenese von C. albicans in vitro57,58,59,60differenziell steuern. Jedoch, technische Zwänge stellen Probleme bei dem Versuch, C. albicans Hyphen Bildung in in vivo Darmproben zu studieren, insbesondere Färbung Hefe und Hyphenzellen und quantitative Analyse der Hyphal-Entwicklung. Um die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt zu verstehen, wurde eine Ex-vivo-Methode entwickelt, bei der lösliche Extrakte mit homogenisiertem Darmgehalt von Mäusen verwendet wurden, um die Wirkung von Metaboliten auf die Pilzhyptohypomorphogenese zu untersuchen. Mit Hilfe von Darmproben von Mäusen, die resistent und anfällig für C. albicans GI-Infektion sind, wird diese Methode helfen, die Wirkung von Metaboliten, Antibiotika und Xenobiotika auf Pilzhyptohypomorphogenese im GI-Trakt zu identifizieren und zu studieren.
Die hier beschriebene Methode stellt eine neue Methode dar, um die Wirkung von antibiotika-, diätetischen, xenobiotischen und therapeutischen Auswirkungen auf die Hypahypomorphese von C. albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Da die Mehrheit der systemischen Infektionen aus dem GI-Traktstammen 21,22,23,24,25,26,<…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren würdigen Ressourcen und Unterstützung von Midwestern University Cellular and Molecular Core Research Facility.
1 – 10 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | Misc |
100 – 1000 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-400 | Misc |
20 – 200 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-451 | Misc |
2-methylbutyric acid | Sigma | 193070-25G | hyphal-inhibitory compound |
488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen (Fisher) | A11008 | IF Staining secondary ab |
Agar | Fisher | BP1423-500 | YPD agar component |
Automated Imaging Microscope | Keyence | BZX700 | |
Candida Albicans Antibody | Invitrogen (Fisher) | PA1-27158 | IF Staining primary ab |
cefoperazone | Cayman | 16113 | antibiotic |
deoxycholic acid | Sigma | 30960 | hyphal-inhibitory compound |
D-Glucose | Fisher | D16-500 | hyphal-promoting compound |
forceps | Fisher | 08-885 | |
lactic acid | Alfa Aesar | AAAL13242-06 | hyphal-inhibitory compound |
lithocholic acid | Sigma | L6250-10G | hyphal-inhibitory compound |
palmitic acid | Sigma | P5585-10G | hyphal-inhibitory compound |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | IF Staining fixative |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x | Alfa Aesar | J62692 | PBS component |
p-tolylacetic acid | SCBT | sc-257959 | hyphal-inhibitory compound |
sebacic acid | Sigma | 283258-250G | hyphal-inhibitory compound |
sharp ended scissors | Fisher | 28301 | |
sterile Milli-Q water | N/A | N/A | Misc |
YPD Broth | BD Biosciences | 242810 | YPD agar component |