Extra Cellular Matrix-baserade och extra cellulära Matrix-Free Generation av Murine Testikelorganoider

Testikelorganoider är en banbrytande teknik för att studera testikelutveckling, spermatogenes, och fysiologi in vitro^1,2,3,4. Flera metoder har utforskats för organoid generation; dessa inkluderar en mängd olika extracellulära matrissystem (ECM) och ECM-fria odlingssystem, i både tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) orienteringar. Olika generationsmetoder kan främja distinkta cellulära monteringsstrategier; detta resulterar i en hög nivå av morfologiska och funktionella variabilitet mellan publicerade organoidmodeller. Syftet med denna artikel är att diskutera det aktuella läget för in vitro testikelmodeller, och att fungera som en mall för framtida utredare, när man utformar testikelorganoida experiment. Inom den föreliggande studien definieras fyra olika kultursystems arketyper och karakteriseras i experimentell process och biologiskt utfall. Dessa inkluderar: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, och 3D ECM-odlingsmetoder. De strategier som presenteras häri är avsedda att vara enkla, tillgängliga och mycket reproducerbara mellan olika laboratorier och forskargrupper.

Historiskt för testisen, beteckningen “in vitro”, har använts för flera olika odlingsmetoder av testikelvävnader och celler. Dessa inkluderar organotypisk vävnad/organ odling metoder (dvs. explant kultur)⁵, isolerade seminiferous tubule kultur⁶, testikelcellsodling⁷, och metoder för de novo vävnad morphogenesis (dvs, biologiska konstruktioner och organoider)¹. De första undersökningarna av in vitro-spermatogenes utfördes för ungefär 100 år sedan, med kulturen av kanintestis explants i 1920⁸, och senare i 1937 med mus explants⁹. Inom dessa inledande experiment spermatogonia observerades till stor del urarta under den första veckan av kultur, även om vissa meiotically differentiera celler identifierades. Påminner om dessa historiska rapporter, testis explant kultur återupplivades och optimerades 2011 för att bli en genomförbar teknik för att studera testis¹⁰. Sedan 2011, explant kultur har producerat fertilitet kompetent spermie i flera rapporter^11,12,13. Men på grund av explant kulturens beroende av redan existerande inhemska testis tubuli, dessa senaste framsteg är mer exakt beskrivs som exempel på “ex vivo” testikelfunktion och spermatogenes, vävnadsfunktion som bibehölls eller återupptogs vid avlägsnande från en organism kropp. Trots dess prevalens i litteraturen, långsiktiga könsceller underhåll och differentiering inom testikel explants är utmanande att replikera^{14,15,16,17,18}, särskilt över tidsramar tillräckligt länge för att fullt ut observera in vitro spermatogenes (~ 35 dagar i möss¹⁹ och 74 hos människor²⁰). Det är spännande att inse att många av de utmaningar som upplevdes för 100 år sedan, fortfarande upplevs inom ex vivo spermatogenes idag.

Annorlunda än ex vivo tillvägagångssätt, testikelorganoider är de novo monterade mikrotissues genereras helt in vitro från cellulära källor (dvs. primära testikelceller). Testikelorganoider ger en kreativ strategi för att kringgå fältets historiska tillit till redan existerande inhemska vävnad, och att rekapitulera testikelbiologi helt in vitro. Det finns flera krav som delas av de flesta organoid vävnadsmodeller; dessa inkluderar (1) in vivo-mimetic vävnad morfologi eller arkitektur, (2) flera större celltyper av den representerade vävnaden, (3) självmontering eller självorganisation i sin generation, och (4) förmågan att simulera en viss nivå av den representerade vävnadens funktion och fysiologi^21,22,23,24. För testierna kan detta fångas upp i fyra större kännetecken: (1) införandet av större testikelcellstyper, groddar, Sertoli, Leydig, peritubular och andra interstitialceller, (2) cell-directed tissue assembly, (3) lämpligt-compartmentalized celltyper i separata tubular fack (könsceller och Sertoli) och interstitial regioner (alla andra celltyper), och (4) någon grad av vävnad funktion (t.ex., reproduktiv hormonsekretion eller vävnad svar, och könsceller underhåll och differentiering). Med tanke på de historiska utmaningarna i att upprätthålla könscellsdifferentiering ex vivo och in vitro, rekapitulation av in vivo-mimetic testikelarkitekturer (dvs strukturer som liknar seminiferous tubules) med ytterligare markörer som tyder på simulering av testikelfysiologi (t.ex. endokrina funktion), är prioriterade milstolpar mot att generera organoider som en dag kan upprätthålla i vitro spermaogenes.

Majoriteten av publicerade testikelorganoida metoder dra nytta av kommersiellt tillgängliga ECM (t.ex. kollagen eller egenutvecklade ECM formuleringar)^25,26,27 eller custom-sourced ECMs (dvs, decellularized testis ECM-derived hydrogels)^28,29,30. Exogen ECM främjar de novo vävnadsbildning genom att tillhandahålla en monterings-stödjande byggnadsställning för vävnadsgenerering. ECM metoder har gett en imponerande nivå av vävnadsbildning, inklusive vissa groddcell närvaro och vävnad-mimetic morfologi^25,28. Men de ECM de utnyttjar är inte alltid allmänt tillgängliga (dvs. decellularized ECM-härledda hydrogels), och vissa metoder kräver sofistikerade gel och cell seedning orienteringar (t.ex. 3-lagers lutningar av ECM och 3D-utskrift)^25,31,32. Byggnadsställningsfria metoder (t.ex. hängande droppe och nonadherent odlingsplattor)^33,34,35 har också genererat robusta och mycket reproducerbara organoider utan behov av ECM-geler eller byggnadsställningar. Men vävnad morfologi av dessa byggnadsställning-fria organoider är ofta olika till in vivo testiklar, och de flesta av dessa rapporter införliva en biokemisk ECM tillsats för att främja vävnadsbildning^33,34,36, eller alternativt, förlita sig på centrifugation för påtvingad cell aggregering och packning³⁴, vilket gör dem mindre idealisk för att studera cell-riktad migration och självorganisering.

De fyra organoida generationsmetoderna som presenteras i detta manuskript omfattar både ECM-beroende och oberoende strategier, var och en med hjälp av enkel cellsådd som möjliggör observation av celldriven organoid självmontering. Alla fyra tekniker kan utföras från samma cell suspensioner eller kan använda sig av anpassade och cell-typ berikade populationer. En styrka av dessa metoder är förmågan att observera organoider självmontera i realtid, och att direkt jämföra hur testikelstrukturer själv montera mellan olika kultur mikromiljöer. De fenotypiska skillnaderna mellan dessa fyra odlingsmetoder bör övervägas för deras inverkan på forskningsfrågan eller föremål för prövaren. Varje metod producerar biologiska konstruktioner eller organoider inom 24 h eller mindre. Sammanfattningsvis de metoder som presenteras här ger en verktygslåda av organoid montering tekniker för att studera testikelorganoida församling, vävnad utveckling och testikelfysiologi in vitro.