Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro^1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwischen veröffentlichten Organoidmodellen. Der Zweck dieses Artikels ist es, den aktuellen Zustand von In-vitro-Hodenmodellen zu diskutieren und als Vorlage für zukünftige Forscher bei der Entwicklung von Hodenorganoidexperimenten zu dienen. In der vorliegenden Studie werden vier verschiedene Kultursystemarchetypen definiert und in experimentellen Prozess- und biologischen Ergebnissen charakterisiert. Dazu gehören: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free und 3D ECM Kulturmethoden. Die hier vorgestellten Strategien sollen einfach, zugänglich und zwischen verschiedenen Laboratorien und Forschungsgruppen hochgradig reproduzierbar sein.

Historisch für die Hoden, die Bezeichnung “in vitro”, wurde für mehrere verschiedene Kulturmethoden von Hodengeweben und -zellen verwendet. Dazu gehören organotypische Gewebe-/Organkulturmethoden (d.h. Explantkultur)⁵, isolierte seminiferöse Tubulenkultur⁶, Hodenzellkultur⁷und Methoden der de novo Gewebemorphogenese (d.h. biologische Konstrukte und Organoide)¹. Die ersten Untersuchungen zur In-vitro-Spermatogenese wurden vor etwa 100 Jahren mit der Kultur der Kaninchen-Hodenexplantationen 1920⁸und später 1937 mit Mausexplantationen⁹durchgeführt. Innerhalb dieser ersten Experimente wurden Spermatogonien beobachtet, die in der ersten Kulturwoche weitgehend degenerierten, obwohl einige meiotisch differenzierende Zellen identifiziert wurden. Erinnert an diese historischen Berichte, wurde die Testis-Explantationskultur 2011 wiederbelebt und optimiert, um eine praktikable Technik zum Studium der Hoden¹⁰zu werden. Seit 2011 hat explant kultur Fruchtbarkeit kompetente Spermien in mehreren Berichten produziert^11,12,13. Doch aufgrund der Abhängigkeit der Explant-Kultur von bereits existierenden nativen Hobules werden diese jüngsten Fortschritte genauer als Beispiele für “ex vivo” Hodenfunktion und Spermatogenese beschrieben, Gewebefunktion, die bei der Entfernung aus dem Körper eines Organismus beibehalten oder wieder aufgenommen wurde. Trotz seiner Prävalenz in der Literatur, langfristige Keimzellerhaltung und Differenzierung innerhalb hoden Explants ist eine Herausforderung zu replizieren^{14,15,16,17,18}, vor allem über Zeitrahmen lang genug, um vollständig zu beobachten In-vitro-Spermatogenese (35 Tage bei Mäusen¹⁹ und 74 beim Menschen²⁰). Es ist faszinierend zu erkennen, dass viele der gleichen Herausforderungen, die vor 100 Jahren erlebt wurden, noch heute in der ex vivo Spermatogenese erlebt werden.

Im Unterscheidet sich von Ex-vivo-Ansätzen sind Hodenorganoide de novo zusammengesetzte Mikrotissues, die vollständig in vitro aus zellulären Quellen (d. h. primären Hodenzellen) erzeugt werden. Hodenorganoide bieten eine kreative Strategie, um die historische Abhängigkeit des Feldes von bereits vorhandenem nativem Gewebe zu umgehen und die Hodenbiologie vollständig in vitro zu rekapitulieren. Es gibt mehrere Anforderungen, die von den meisten organoiden Gewebemodellen geteilt werden; Dazu gehören (1) in vivo-mimetische Gewebemorphologie oder Architektur, (2) mehrere Hauptzelltypen des dargestellten Gewebes, (3) Selbstmontage oder Selbstorganisation in ihrer Erzeugung und (4) die Fähigkeit, eine gewisse Ebene der Funktion des dargestellten Gewebes und der Physiologie zu simulieren^21,22,23,24. Für die Hoden kann dies in vier Hauptmerkmalen erfasst werden: (1) die Einbeziehung von Haupthodenzelltypen, Keim, Sertoli, Leydig, peritubular und andere interstitielle Zellen, (2) zellgesteuerte Gewebeanordnung, (3) entsprechend kompartalisierte Zelltypen in separate röhrenförmige Kompartimente (Keim und Sertoli) und interstitielle Regionen (alle anderen Zelltypen) und (4) ein gewisses Maß an Gewebefunktion (z. B. Reproduktivhormonsekretion oder Gewebereaktionen und Zellabhängigkeit). Unter Berücksichtigung der historischen Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Keimzelldifferenzierung ex vivo und in vitro sind die Rekapitulation in vivo-mimetischer Hodenarchitekturen (d. h. Strukturen, die seminiferous tubulis ähneln) mit zusätzlichen Markern, die auf die Simulation der Hodenphysiologie (z. B. endokrine Funktion) hindeuten, vorrangige Meilensteine zur Erzeugung von Organoiden, die eines Tages die in vitro erhaltene Spermatogenese aufrechterhalten könnten.

Die meisten veröffentlichten Hodenorganoid-Methoden nutzen kommerziell erhältliche ECM (z.B. Kollagen oder proprietäre ECM-Formulierungen)^25,26,27 oder kundenspezifische ECMs (d.h. dezelluläre Hoden ECM-abgeleitete Hydrogele)^28,29,30. Exogenes ECM fördert die De-Novo-Gewebebildung durch bereitstellung eines Montage-unterstützenden Gerüstes für die Gewebebildung. ECM-Methoden haben ein beeindruckendes Maß an Gewebebildung ermöglicht, einschließlich einiger Keimzellpräsenz und gewebemimetischer Morphologie^25,28. Die von ihnen verwendeten ECMs sind jedoch nicht immer universell verfügbar (d. h. dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele), und einige Methoden erfordern ausgeklügelte Gel- und Zellsaatausrichtungen (z. B. 3-Schicht-Gradienten des ECM- und 3D-Drucks)^25,31,32. Gerüstfreie Methoden (z.B. hängende Tropfen und nicht haftende Kulturplatten)^33,34,35 haben auch robuste und hoch reproduzierbare Organoide ohne ECM-Gele oder Gerüste erzeugt. Jedoch, die Gewebemorphologie dieser Gerüst-freien Organoide ist oft unähnlich zu in vivo Hoden, und die meisten dieser Berichte enthalten eine biochemische ECM-Additiv zur Förderung der Gewebebildung^33,34,36, oder alternativ, verlassen sich auf Zentrifugierung für erzwungene Zellaggregation und Verdichtung³⁴, so dass sie weniger ideal für die Untersuchung zellgesteuerte Migration und Selbstorganisation.

Die vier in diesem Manuskript vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden umfassen sowohl ECM-abhängige als auch unabhängige Strategien, die jeweils eine einfache Zellaussaat verwenden, die die Beobachtung der zellgesteuerten organoiden Selbstmontage ermöglicht. Alle vier Techniken können aus denselben Zellsuspensionen ausgeführt werden oder benutzerdefinierte und zelltypangereicherte Populationen verwenden. Eine Stärke dieser Methoden ist die Fähigkeit, Organoide in Echtzeit selbst zu beobachten und direkt zu vergleichen, wie hodenförmige Strukturen sich zwischen verschiedenen Kulturmikroumgebungen selbst zusammensetzen. Die phänotischen Unterschiede zwischen diesen vier Kulturmethoden sollten wegen ihrer Auswirkungen auf die Forschungsfrage oder das Thema des Prüfers berücksichtigt werden. Jede Methode produziert biologische Konstrukte oder Organoide innerhalb von 24 h oder weniger. Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden ein Toolkit von organoiden Montagetechniken zum Studium der Hodenorganoid-Montage, Gewebeentwicklung und Hodenphysiologie in vitro bieten.