Ekstra cellulær matrisebasert og ekstra cellulær matrix-fri generasjon av murine testikkel organoider

Testicular organoider er en banebrytende teknikk for å studere testikkelutvikling, spermatogenese og fysiologi in vitro^1,,2,,3,,4. Flere metoder har blitt utforsket for organoid generasjon; Disse inkluderer en rekke ekstracellulære matrise (ECM) og ECM-frie kultursystemer, i både todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) retninger. Ulike generasjonsmetoder kan fremme distinkte cellulære monteringsstrategier; dette resulterer i et høyt nivå av morfologiske og funksjonelle variasjoner mellom publiserte organoidmodeller. Formålet med denne artikkelen er å diskutere den nåværende tilstanden til in vitro testikkelmodeller, og å tjene som en mal for fremtidige etterforskere, når du utformer testikkelorganoide eksperimenter. I den nåværende studien er fire forskjellige kultursystemarketyper definert og karakterisert i eksperimentell prosess og biologisk utfall. Disse inkluderer: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free og 3D ECM kultur metoder. Strategiene som presenteres her, er ment å være enkle, tilgjengelige og svært reproduserbare mellom ulike laboratorier og forskningsgrupper.

Historisk for testis, betegnelsen “in vitro”, har blitt brukt til flere forskjellige kulturmetoder for testikkelvev og celler. Disse inkluderer organotypisk vev / organ kultur metoder (det vil si explant kultur)⁵, isolert seminiferous tubule kultur^6,testicular celle kultur⁷, og metoder for de novo vev morphogenesis (det vil si biologiske konstruksjoner og organoider)¹. De første undersøkelsene av in vitro spermatogenese ble utført for ca 100 år siden, med kulturen av kanin testis explants i 1920⁸, og senere i 1937 med musen explants⁹. Innenfor disse første forsøkene spermatogonia ble observert å i stor grad degenerere over den første uken av kultur, selv om noen meiotically differensiering celler ble identifisert. Som minner om disse historiske rapportene, testis explant kultur ble gjenopplivet og optimalisert i 2011 for å bli en mulig teknikk for å studere testis¹⁰. Siden 2011, explant kultur har produsert fruktbarhet kompetent sperm i flere rapporter^11,12,13. Likevel, på grunn av explant kulturens avhengighet av eksisterende innfødte testis tubuli, disse siste fremskrittene er mer nøyaktig beskrevet som eksempler på “ex vivo” testicular funksjon og spermatogenese, vev funksjon som ble opprettholdt eller gjenopptatt ved fjerning fra kroppens kropp. Til tross for sin utbredelse i litteraturen, langsiktig bakteriecellevedlikehold og differensiering innen testikkel explants er utfordrende^{å gjenskape 14,15,16,17,18}, spesielt over tidsrammer lenge nok til å fullt ut observere in vitro spermatogenese (~ 35 dager i mus¹⁹ og 74 hos mennesker²⁰). Det er spennende å sette pris på at mange av de samme utfordringene opplevd 100 år siden, er fortsatt opplevd innen ex vivo spermatogenesis i dag.

Forskjellig fra ex vivo tilnærminger, testicular organoider er de novo montert mikrotissuer generert helt in vitro fra cellulære kilder (f.eks. primære testikkelceller). Testicular organoider gir en kreativ strategi for å omgå feltets historiske avhengighet av eksisterende innfødt vev, og å rekafulere testikkelbiologi helt in vitro. Det er flere krav som deles av de fleste organoide vevsmodeller; disse inkluderer (1) in vivo-mimetic vev morfologi eller arkitektur, (2) flere store celletyper av representert vev, (3) selvmontering eller selvorganisme i sin generasjon, og (4) evnen til å simulere noen nivå av representert vev funksjon og fysiologi^{21,,22,,23,24}. For testis, dette kan fanges i fire store kjennetegn: (1) inkludering av store testikkelcelletyper, bakterie, Sertoli, Leydig, peritubular og andre interstitielle celler, (2) celle-rettet vev montering, (3) hensiktsmessig compartmentalized celletyper i separate rørformede rom (bakterie og Sertoli) og interstitielle regioner (alle andre celletyper), og (4) en viss grad av vev funksjon (f.eks reproduktive hormon sekresjon eller vev svar, og bakterie celle vedlikehold og differensiering). Tatt i tanke på de historiske utfordringene med å opprettholde bakteriecelledilatering ex vivo og in vitro, er oppsummeringen av in vivo-mimetiske testikkelarkitekturer (f.eks. strukturer som ligner seminiferøse tubuli) med flere markører som antyder simulering av testikkelfysiologi (f.eks. endokrine funksjon), prioriterte milepæler mot generering av organoider som en dag kan opprettholde in vitro spermatogenesis.

De fleste publiserte testikkelorganoidmetoder drar nytte av kommersielt tilgjengelige ECM (f.eks. kollagen eller proprietære ECM-formuleringer)^25,,26,,27 eller spesialutlede ECM-er (f.eks. decellulariserte tester ECM-avledede hydrogeler)^28,,29,,30. Eksogen ECM fremmer de novo vevdannelse gjennom å gi et monteringsstøttende stillas for vevsgenerering. ECM metoder har gitt et imponerende nivå av vevdannelse, inkludert noen bakteriecelle tilstedeværelse og vev-mimetisk morfologi^25,28. EcMs de benytter er imidlertid ikke alltid universelt tilgjengelige (f.eks. decellulariserte ECM-avledede hydrogeler), og noen metoder krever sofistikerte gel- og cellesåingsretninger (f.eks. 3-lags graderinger av ECM og 3D-utskrift)^25,,31,,32. Stillasfrie metoder (f.eks. hengende dråpe og ikke-adhegerent kulturplater)^33,34,35 har også generert robuste og svært reproduserbare organoider uten behov for ECM geler eller stillas. Imidlertid er vevmorfologien til disse stillasfrie organoidene ofte forskjellige fra in vivo testiklene, og de fleste av disse rapportene inkluderer et biokjemisk ECM-additiv for å fremme^{vevsdannelse 33,34,,36}eller alternativt stole på sentrifugering for tvungen celleaggregasjon og^{komprimering 34,}noe som gjør dem mindre ideelle for å studere cellerettet migrasjon og selvorganisering.

De fire organoidgenerasjonsmetodene som presenteres i dette manuskriptet inkluderer både ECM-avhengige og uavhengige strategier, som hver bruker enkel cellesåing som muliggjør observasjon av celledrevet organoid selvmontering. Alle fire teknikkene kan utføres fra de samme cellesuspensjonene eller kan gjøre bruk av tilpassede og celle-type berikede populasjoner. En styrke av disse metodene er evnen til å observere organoider selvmontering i sanntid, og å direkte sammenligne hvordan testikkelstrukturer selv monterer mellom ulike kulturmikromiljøer. De fenotypiske forskjellene mellom disse fire kulturmetodene bør vurderes for deres innvirkning på forskningsspørsmålet eller gjenstand for utprøver. Hver metode produserer biologiske konstruksjoner eller organoider innen 24 timer eller mindre. Til slutt gir metodene som presenteres her en verktøykasse med organoide monteringsteknikker for å studere testikkelorganoid montering, vevsutvikling og testikkelfysiologi in vitro.