추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및^생리학을연구하기 위한 선구적인 기술이다^1,2,,3,,4. 몇 가지 방법은 오르가노이드 생성을 위해 탐구되었습니다; 여기에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 방향 모두에서 다양한 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM 프리 배양 시스템이 포함됩니다. 다른 세대 방법은 별개의 세포 조립 전략을 촉진 할 수있다; 이로 인해 게시된 오르가노이드 모델 간의 높은 수준의 형태학적 및 기능적 가변성을 초래합니다. 이 문서의 목적은 시험관 내 고환 모델의 현재 상태를 논의하고 고환 오르가노이드 실험을 설계 할 때 미래의 조사자를위한 템플릿 역할을하는 것입니다. 본 연구에서는, 4개의 상이한 배양 시스템 원형이 실험 과정 및 생물학적 결과로 정의되고 특징지입니다. 여기에는 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free 및 3D ECM 배양 방법이 포함됩니다. 여기에 제시된 전략은 다른 실험실과 연구 그룹 간에 간단하고 접근 가능하며 매우 재현할 수 있도록 하기 위한 것입니다.

역사적으로 고환에 대 한, 지정 “시험관”, 고환 조직 및 세포의 몇 가지 다른 문화 방법에 대 한 사용 되었습니다. 이들 로는 조직/장기 배양 방법(즉, 절제배)^5,분리된 반열성 관배기 배양^6,고환 세포 배양^7,및 드노보 조직 형태발생(즉, 생물학적 구조 및 오르가노이드)^1을포함한다. 체외 정자 발생에 대한 첫 번째 조사는 약 100년 전에 수행되었으며, 1920년^8년에토끼 고환의 배양, 그리고 1937년 후반에는 마우스 이식^9로수행되었다. 이러한 초기 실험 내에서 정자는 문화의 첫 주에 걸쳐 크게 퇴화하는 것으로 관찰되었다, 일부 메이오티분스 분화 세포가 확인되었지만. 이러한 역사적 보고서를 연상시키는 고환 절제 문화는 2011년에 부활하여 최적화되어 testis^10을연구할 수 있는 가능한 기술이 되었습니다. 2011년부터, 절제문화는^{다중 보고11,,12,13에서}불임 유능한^정자를생산하고 있다. 그러나, 기존의 네이티브 고환 튜블러에 대한 절제 문화의 의존으로 인해, 이러한 최근의 발전은 “ex vivo”고환 기능 및 정자 발생, 유기체의 신체에서 제거 시 유지되거나 재개된 조직 기능의 예로 보다 정확하게 설명된다. 문학에 그것의 보급에도 불구하고, 고환 이질 내의 장기 세균 세포 유지 및 분화는^{14,,15,,16,,17,,18,}특히 완전히 체외 정자 발생 (인간^20에서마우스¹⁹ 및 74에서 35 일)에서 완전히 관찰하기에 충분한 기간 동안 복제하기 어렵다. 100년 전에 경험한 많은 도전들이 오늘날에도 전 생체 내 정자 발생에서 여전히 경험된다는 사실에 흥미롭습니다.

전 생체 내 접근법과 는 달리, 고환 오르가노이드는 세포 공급원(즉, 1차 고환 세포)으로부터 시험관내에서 완전히 생성된 데 노보 조립 마이크로티슈이다. 고환 오르가노이드는 기존의 토착 조직에 대한 필드의 역사적 의존을 회피하고 시험관 내에서 고환 생물학을 완전히 재구성하는 창의적인 전략을 제공합니다. 대부분의 오르가노이드 조직 모델에 의해 공유 되는 여러 요구 사항이 있다; 이들(1)은 생체-모방 조직 형태 또는 건축, (2) 전이 조직의 다중 주요 세포 유형, (3) 자체 조립 또는 자가 조직 생성, (4) 표현된 조직의 기능 및 생리학의 어느 수준을 시뮬레이션하는^{능력(21,,22,,23,,24)을}포함한다. 고환의 경우, 이것은 4가지 주요 특징에서 포착될 수 있습니다: (1) 주요 고환 세포 모형의 포함, 세균, 세르톨리, 레이디그, 관류 및 기타 간질 세포, (2) 세포 지향 조직 조립, (3) 적절한 구획화된 세포 유형이 별도의 관구구체(세균 및 세르톨리) 및 간질 영역(다른 모든 세포 유형), 및 (4) 조직 기능(예를 들어, 생식 호르몬 비결 반응 및 조직 유지 관리)의 어느 정도. 생식 세포 분화 전 생체 외및 시험관 내의 역사적 과제를 고려하여, 생체 내 모방 고환 아키텍처(즉, 반전류 관과 유사한 구조)의 재구성은 고환 생리학의 시뮬레이션(예: 내분비 기능)을 생성하는 데 우선순위가 될 수 있습니다.

공표된 고환 오르가노이드 방법의 대부분은 시판되는 ECM(예를 들어, 콜라겐 또는 독점 ECM 제형)^25,,26,,27 또는 맞춤형 C롬(즉, 탈세포화된 고환 ECM 유래 하이드로겔)^{28,,29,,30을}이용한다. 외인성 ECM은 조직 생성을 위한 조립 지원 발판을 제공함으로써 드 노보 조직 형성을 촉진한다. ECM 방법은 일부 생식 세포 존재 및 조직 모방 형태^{25, 28을,}포함하여 조직 형성의 인상적인 수준을^{부여하고있다.} 그러나, 이들이 사용하는 EM은 항상 보편적으로 이용가능한 것은 아니며(즉, 세포제거 ECM 유래 하이드로겔) 및 일부 방법은 정교한 젤 및 세포 파종(예: ECM 및 3D 프린팅의 3층 그라데이션)을^{25,,,31,32로}필요로 한다. 스캐폴드 없는 방법(예: 매달려 있는 드롭 및 비부착 배양 판)^{33,,34,,35도} ECM 젤이나 스캐폴드 없이 견고하고 재현성이 높은 오르가노이드를 생성하였다. 그러나, 이러한 비계없는 오르가노이드의 조직 형태는 종종 생체 내 고환과 유사하며, 이들 보고서의 대부분은 조직 형성을 촉진하기 위해 생화학 ECM 첨가제를^{통합33,,34,,36,}또는 대안적으로, 강제 세포 집계 및 다짐에 대한 원심분리에 의존34, 세포 지향 적 이주 조직을 연구하는 데 덜 이상적으로 만들기.³⁴

이 원고에 제시된 4개의 organoid 생성 방법은 세포 중심 의 오르가노이드 자기 조립을 가능하게 하는 간단한 세포 파종을 사용하여 각각 ECM 의존성 및 독립적인 전략을 둘 다 포함합니다. 모든 4가지 기술은 동일한 세포 현탁액에서 수행될 수 있거나 사용자 지정 및 세포 형 농축 된 집단을 사용할 수 있습니다. 이러한 방법의 강점은 오르가노이드가 실시간으로 자체 조립되는 것을 관찰하고 고환 구조가 다른 배양 마이크로환경 사이에서 어떻게 자체 조립되는지 직접 비교할 수 있는 능력입니다. 이 4개의 문화 방법 사이 현상 차는 연구 질문 또는 조사자의 주제에 그들의 영향에 대 한 고려 되어야 한다. 각 방법은 24시간 이하 의 생물학적 구조 또는 오르가노이드를 생성합니다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 시험관 내 고환 기관지 조립, 조직 발달 및 고환 생리학을 연구하기 위한 오르가노이드 조립 기술의 툴킷을 제공한다.