在这里,我们描述了一种使用基于 piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体在人类多能干细胞中进行无缝基因编辑的详细方法。将两点突变引入人胚胎干细胞(hESCs)肝细胞核因子4α(HNF4α)位点的外显子8。
定制设计的核酸内切酶,如RNA引导的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9,能够在哺乳动物细胞中进行高效的基因组编辑。在这里,我们描述了无缝基因组编辑肝细胞核因子4α(HNF4α)位点的详细程序,作为人类多能干细胞的一个例子。在两步遗传选择中结合基于 piggyBac的供体质粒和CRISPR-Cas9切口酶突变体,我们证明了HNF4α位点的正确和有效靶向。
人类多能干细胞(hPSCs)代表了用于研究或临床的无限体细胞来源1。hPSC中的基因靶向提供了一种强大的方法来研究细胞特异性过程中的基因功能和了解疾病的机制。尽管存在有效的基因组编辑方法,但修饰hPSC中的基因在技术上仍然具有挑战性。hPSCs中通过同源重组进行的标准基因靶向频率较低,甚至在某些基因2上检测不到,因此在这些细胞中需要DNA双链断裂(DSB)刺激的基因靶向(称为基因编辑)2,3。此外,hPSCs的转染和随后的单细胞克隆不是很有效,即使通过使用Rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂4可以减少单细胞相关细胞凋亡。最后,目的基因上潜在的靶向和脱靶突变也可能是有问题的。因此,可靠的方案对于在hPSC中进行量身定制的遗传变化至关重要。
RNA引导的CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)和CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术现在是基因编辑的成熟工具。转录的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)形成单一向导RNA(sgRNA),其与Cas9蛋白复合,允许基因特异性切割5。CRISPR/Cas9系统是通过改变sgRNA的20 bp引导序列来编程的,这意味着几乎任何满足原间隔邻序(PAM)要求的位点都可以被编辑。然而,野生型Cas9可以容忍其引导序列和DNA靶标之间的一些不匹配,这可能会导致不必要的脱靶效应。为了提高其特异性,已经开发出一种切口酶突变体(Cas9n)。含有D10A或N863A突变的Cas9n仅具有一个功能性核酸酶结构域,因此只能在一条链上切开DNA。一对适当间隔和定向的Cas9n可以有效地诱导DNA DSB,并且脱靶效应显着降低6。为了确保有效的Cas9n修饰,已经表明,理想情况下,两个Cas9n-sgRNA应以-4至20 bp的偏移放置,并始终产生5’突出6。
Cas9(n)-sgRNA诱导的DSB可用于hPSC7,8的基因组编辑。它可以通过非同源末端连接修复产生基因敲除,或者如果存在供体DNA模板,则通过同源定向修复(HDR)引入基因修饰。这里描述的方案使用基于piggyBac转座子的供体质粒(或靶向载体)进行HDR,其中耐药性标记物两侧是转座子倒置重复序列。这种方法的优点包括有效的筛选和无缝的基因编辑,正如Yusa等人首先证明的那样9,10。药物选择盒允许用整合载体富集细胞,随后通过连接PCR筛选细胞以鉴定HDR衍生的细胞。此外,可以定位药物选择盒以替换Cas9(n)切割的目标序列,因此HDR后不会发生进一步的DNA断裂,从而消除了Cas9(n)重新切割引起的“on”靶突变。此外,通过利用piggyBac转座酶催化的精确切除,然后将选择标记从基因组中切除而不会留下疤痕。去除药物选择标记9后,仅保留用于piggyBac插入的原始内源性TTAA序列。即使必须通过引入替代来创建TTAA站点,与其他方法相比,干扰监管元素的机会也会减少10。
在这里,我们描述了在hPSC中实施无缝基因组编辑的详细程序。在两步遗传选择中结合基于 piggyBac的供体质粒和CRISPR-Cas9切口酶突变体,我们将两个预定点突变引入肝细胞核因子4α(HNF4α)基因11中。这种方法可靠且高效,并且可以深入分析HNF4α在人多能干细胞的内胚层和肝细胞规格中所起的重要作用11。
本文描述的方案可用于将预定点突变引入hPSCs的内源性位点。基于 piggyBac的靶向载体和配对的CRISPR/Cas9n表达质粒的组合被证明是可靠和有效的11。在HNF4α基因编辑之后,通过连接PCR筛选确定的43个分析克隆中有12个被正确靶向。具体而言,双等位基因靶向效率约为21%(9/43),单等位基因靶向效率约为7%(3/43)。
在靶向实验之后,维持嘌呤霉素的选择至关重要,以便在第一轮筛选期间保持目标位点可及小 猪Bac 转座酶。这将最大限度地减少PGK启动子驱动的puro-deltaTK选择盒的沉默,并减少第二轮筛选10的背景。最近的一份报告显示,在hPSC14中,CAG启动子比PGK启动子更耐沉默。因此,更换选择盒的启动器可以在未来改进该系统。比较hyPBase和GFP转染细胞的耐药菌落数量也很重要。成功去除转座子后,hyPBase-的存活菌落应该比GFP转染的细胞更多。除了转座子切除的PCR分析外,还需要对修饰区域进行直接测序以确认切除保真度。
基于Yusa的基于piggyBac转座子的靶向载体策略9,10,上述程序侧重于提高hPSCs核转染和单细胞克隆效率。优化细胞接种密度以减少异质集落形成的可能性。我们还采用10%CO2下的10-12天培养来提高基因型筛选的菌落产量。根据我们的经验,每个96孔板可以获得大约20个菌落。尽管此步骤可能比其他方法花费更多时间,但它可靠且高效。
根据需要,可以设计靶向载体来引入或纠正点突变,创建报告细胞系以及敲除基因表达。总之,CRISPR/Cas9(n)系统和靶向载体的结合是递送不同类型转基因hPSC的有效方法。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Kosuke Yusa分享pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK和pCMV-hyPBase质粒。我们感谢Jia-Yin Yang和Karamjit Singh-Dolt关于基因组编辑的有益讨论。D.C.H.实验室得到了首席科学家办公室(TC/16/37)和英国再生医学平台(MR/L022974/1)的奖项支持。Y.W.得到了中国国家留学基金委和爱丁堡大学资助的博士奖学金的支持。
Anti-Human SSEA4 PE | eBioscience | 12-8843-42 | |
Anti-Human TRA-1-60 PE | eBioscience | 11-0159-42 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
DPBS with calcium and magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
FIAU | Moravek | M251 | |
Gentle cell dissociation reagent | Stem Cell Technologies | 07174 | |
H9 human embryonic stem cells | WiCell | WA09 | |
Human NANOG antibody | R&D systems | AF1997 | |
Human OCT4 antibody | Abcam | AB19857 | |
Human stem cell Nucleofector kit 1 | Lonza | VPH-5012 | |
Mouse IgG3 isotype control PE | eBioscience | 12-4742-41 | |
mTeSR1 medium | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Nucleofector 2b device | Lonza | AAB-1001 | |
pCMV-hyPBase | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pMCS-AAT_PBPGKpuroTK | Wellcome Trust Sanger Institute | N/A | |
pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462) | Addgene | PX462 | |
Puromycin dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 | |
QIAprep spin maxiprep kit | Qiagen | 12162 | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Recombinant laminin 521 | BioLamina | LN521 | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Y-27632(Dihydrochloride) | Millipore | SCM075 |