Summary

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Published: June 26, 2020
doi:

Summary

Se ha notificado un método para la entrega de células madre neurales, adaptable para inyectar soluciones o suspensiones, a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) después de un accidente cerebrovascular isquémico. Las células inyectadas se distribuyen ampliamente por todo el parénquima cerebral y se pueden detectar hasta 30 d después del parto.

Abstract

La terapia con células madre neurales (NSC) es un tratamiento innovador emergente para accidentes cerebrovasculares, lesiones cerebrales traumáticas y trastornos neurodegenerativos. En comparación con la administración intracraneal, la administración intraextesal de INE es menos invasiva y produce una distribución más difusa de las RSE dentro del parénquima cerebral. Además, la administración intra arterial permite el efecto de primer paso en la circulación cerebral, disminuyendo el potencial de captura de células en órganos periféricos, como el hígado y el bazo, una complicación asociada con las inyecciones periféricas. Aquí, detallamos la metodología, tanto en ratones como en ratas, para la entrega de INE a través de la arteria carótida común (ratón) o la arteria carótida externa (rata) al hemisferio ipsilateral después de un accidente cerebrovascular isquémico. Utilizando NSC con etiqueta GFP, ilustramos la distribución generalizada lograda en todo el hemisferio ipsilateral de roedores a 1 d, 1 semana y 4 semanas después del parto postestémico, con una mayor densidad en o cerca del sitio de lesiones isquémicas. Además de la supervivencia a largo plazo, mostramos evidencia de diferenciación de células etiquetadas por GFP a las 4 semanas. El enfoque de entrega intra arterial descrito aquí para las INE también se puede utilizar para la administración de compuestos terapéuticos, y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad a diversos modelos de lesiones y enfermedades del SNC en múltiples especies.

Introduction

La terapia con células madre (SC) tiene un enorme potencial como tratamiento para enfermedades neurológicas, incluyendo accidente cerebrovascular, traumatismo craneoencefálico y demencia1,2,3,4,5,6. Sin embargo, un método eficiente para entregar SCs exógenos al cerebro enfermo sigue siendo problemático2,6,7,8,9,10,11,12,13. Los CC que se administran a través de vías de administración periféricas, incluidas las inyecciones intravenosas (IV) o intraperitoneales (IP), están sujetas a filtrado de primer paso en la microcirculación, especialmente en el pulmón, el hígado, el bazo y el músculo8,,9,,13,,14,lo que aumenta las posibilidades de acumulación de células en zonas no objetivo. El método de inyección intracerebral invasivo da como resultado daños localizados en el tejido cerebral y una distribución muy restringida de SCs cerca del lugar de inyección2,6,8,14,15,16. Recientemente hemos establecido un método de inyección intra-arterial basado en catéter para entregar SCs neuronales exógenos (NSC), que se describe aquí en un modelo de roedores de accidente cerebrovascular isquémico focal. Inducimos una lesión transitoria (1 h) de isquemia-reperfusión en un hemisferio utilizando un filamento recubierto de caucho de silicona para ocluir la arteria cerebral media izquierda (MCA) en el ratón o la rata17,,18,,19. En este modelo hemos observado reproduciblemente aproximadamente 75-85% depresión del flujo sanguíneo cerebral (CBF) en hemisferio ipsilateral con imágenes de laser Doppler o laser speckle17,,19,produciendo déficits neurológicos consistentes17,,18,,19.

Para ahorrar tiempo, el vídeo está configurado para reproducirse al doble de la velocidad normal y no se presentan procedimientos quirúrgicos rutinarios, como la preparación de la piel y el cierre de la herida con sutura y el uso y la configuración de la bomba de jeringa motorizada. El método de administración intra arterial de las CEN se demuestra en el contexto del modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) del accidente cerebrovascular experimental en roedores. Por lo tanto, incluimos el procedimiento de accidente cerebrovascular isquémico transitorio con el fin de demostrar más tarde cómo se realiza la segunda cirugía, la inyección intra-arterial, utilizando el sitio quirúrgico anterior en el mismo animal. La viabilidad de la administración intradesal de NSC en modelos de accidente cerebrovascular de roedores se demuestra mediante la evaluación de la distribución y supervivencia de las RSE exógenas. La eficacia del tratamiento con NSC para atenuar la patología cerebral y la disfunción neurológica se notificará por separado.

Protocol

Todos los procedimientos en temas animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Kentucky, y se tomó el cuidado adecuado para minimizar el estrés o el dolor asociado con la cirugía. 1. Preparación del catéter de inyección y ganchos quirúrgicos Construir el catéter de inyección (Figura 1). Reúna los materiales necesarios, incluyendo: tubos MRE010, MRE025 y MRE050, agujas de inyección …

Representative Results

Los ISC etiquetados por la GFP se detectaron fácilmente en el cerebro isquémico, principalmente en el hemisferio ipsilateral, especialmente en la penumbra y a lo largo del borde de la lesión (Figura 6). El examinador fue ciego durante la toma de imágenes y el análisis. Por ejemplo, a 1 d después de la inyección, se detectaron NSC dentro del hipocampo del ratón. Un subconjunto de NSC mostró coexpresión del marcador de neurona inmaduro DCX en el giro denta…

Discussion

La terapia con células madre para enfermedades neurológicas todavía se encuentra en una etapa exploratoria temprana. Un problema importante es que no existe un método establecido para la entrega suficiente de SCs o NSC en el cerebro.

Aunque se pueden detectar CCS/NSC exógenos en el cerebro después de la inyección intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) o intraparenquimal/intracerebral, cada enfoque de administración tiene inconvenientes. Se estima que la población detectable dentro del…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada por lo siguiente: Premio AHA 14SDG20480186 para LC, equipo de innovación de asignaturas de la Universidad De Shanxi de Medicina China 2019-QN07 para BZ, y Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust subvención 14-12A para KES y LC.

Materials

20 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305175 preparation of injection catheter
26 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305111 preparation of injection catheter
27 G needle Becton & Dickinson BD PrecisionGlide 305136 preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needle Henry Schein Animal Health 56905 surgery
6-0 nylon suture Teleflex/Braintree Scientific 104-s surgery
Accutase STEMCELL Technologies 7922 cell detachment solution
blade Bard-Parker 10 surgery
Buprenorphine-SR Lab ZooPharm Buprenorphine-SR Lab® analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBS VWR 02-0119-0500 NSC dissociation
DCX antibody Millipore AB2253 immunostaining
GFAP antibody Invitrogen 180063 immunostaining
Isoflurane Henry Schein Animal Health 50562-1 surgery
MCAO filament for mouse Doccol 702223PK5Re surgery
MCAO filament for rat Doccol 503334PK5Re surgery
MRE010 catheter Braintree Scientific MRE010 preparation of injection catheter
MRE025 catheter Braintree Scientific MRE025 preparation of injection catheter
MRE050 catheter Braintree Scientific MRE050 preparation of injection catheter
Nu-Tears Ointment NuLife Pharmaceuticals Nu-Tears Ointment eye care during surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled Fine Science Tools 00649-11 surgery
S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight Fine Science Tools 00632-11 surgery
Superglue Pacer Technology 15187 preparation of injection catheter
syringe pump Kent Scientific GenieTouch surgery
Tuj1 antibody Millipore MAb1637 immunostaining
two-component 5 minute epoxy Devcon 20445 preparation of injection catheter
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-08 surgery
vascular clamps Fine Science Tools 00400-03 surgery
Zeiss microscope Zeiss Axio Imager 2 microscopy

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Cite This Article
Zhang, B., Joseph, B., Saatman, K. E., Chen, L. Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (160), e61119, doi:10.3791/61119 (2020).

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