多能性幹細胞からのヒトマクロファージの生成と特性

注:このプロトコルで使用されるすべての試薬と装置は、材料表にリストされています。培地は細胞培養のために37°Cにする必要があります。分化プロトコルで使用される培地および試薬は滅菌性でなければならない。 1. ヒューマン iPSC ラインの解凍とメンテナンス 細胞維持培地、増殖因子、その他の試薬を準備します。 ダルベッコの修飾イーグル培地F12(DMEM/F12)をhESCサプリメント、1.8%w/vウシ血清アルブ(ミン(BSA)、0.1 mM 2メルカプトエタノールで補うことで、hESC-血清フリー培地(hESC-SFM;材料表を参照)を準備します。 無菌0.1%ヒト血清アルブミン(HSA)-リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液にbFGFを溶解することにより、ヒト基礎線維芽細胞成長因子(bFGF)ストック溶液(10μg/mL)を調製。株式溶液を200μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックbFGFは7日間4°Cで保存することができます。 ローキナーゼ阻害剤(ROCK阻害剤)-Y27632ストック溶液(1mg/mL)を滅菌水に溶解して調製します。株式溶液をクライオチューブに50 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、7日間4°Cで保管することができます。 希釈幹細胞基質(材料表を参照) 1:50 ダルベックコのリン酸緩衝塩分カルシウムとマグネシウムで。 希釈した幹細胞の基質溶液を培養プレートに置き、表面積あたりの最終体積が78μL/cm2になるようにします。26ウェルプレートのウェルをコーティングするには、750 μLの溶液を加えます。 コーティングされたプレートを37°Cおよび5%CO2の加湿雰囲気で1時間インキュベート2する。 幹細胞の基質コーティングを吸引し、20 ng/mL bFGFと10 μM ROCK阻害剤を添加したhESCの1 mLを加えます。 凍結したヒトiPSC細胞のバイアルを解凍するには、37°Cでバイアルを解凍して解凍し、細胞を5 mL hESC-SFM培地に移します。 遠心分離細胞は100xggで3分間。 20 ng/mL bFGFおよび10 μM ROCK阻害剤を補充した0.5 mL hESC-SFMで再中断する。コーティングウェルに細胞を移す。 培養細胞は24時間用である。 20 ng /mL bFGFを補ったhESC-SFMにメディアを変更しますが、ROCK阻害剤なし。 細胞を維持するには、細胞が80%の合流度に達するまで、毎日培地を変更します。未分化iPSCは、通常、80%の合流に達するまでに3〜4日かかります。 細胞が80%の合流度に達したら、通過細胞。 20 ng/mL bFGF(ROCK阻害剤なし)を補充した新鮮なhESC-SFMの1.5 mLで使用済み培地を置き換えます。 培養容器を片手に持ち、使い捨てのセルパッセジングツール(材料表を参照)をプレートを横切って一方向(すなわち、左から右)に転がします。ローラーのすべてのブレードがプレートに触れている必要があります。転がりながら均一な圧力を維持する。 全体の井戸が覆われるまで、同じ方向に転がりを繰り返します。 培養容器を90°回転させ、ステップ1.12.2および1.12.3の説明に従って繰り返し転がします。 使用後にパスツールを破棄します。 滅菌ピペットを使用して、切断されたコロニーを取り除くために井戸内の媒体を使用する。 細胞をプレコートされた幹細胞の基質ウェル(ステップ1.2-1.5)に1:4の比率で、ウェルあたり1.5 mLの最終媒体容積(hESC-SFMを補う20 ng/mL bFGF)に移す。 2. ヒトiPSCライン凍結 iPSC細胞を凍結するには、6ウェルプレートの70%~80%コンフルエントウェルの培地を、20 ng/mL bFGFと10 μM ROCK阻害剤を補充したhESC-SFMで交換してください。 37°Cで、5%CO2で1時間2 インキュベートする。 細胞通過ツールでコロニーを切断し、遠心分離管に外れたコロニーを配置します。 遠心分離細胞は100xggで3分間。 培地を吸引し、細胞凍結保存媒体の1 mLで細胞を再中断する(資料表を参照)。 細胞を2つの凍結細胞に均等に分け、4°Cの冷蔵前細胞凍結保存容器に入れます。 細胞を-80°Cで24~48時間保存します。 バイアルを -135 °C 冷凍庫または液体窒素タンクに移します。 3. マクロファージへのヒトiPSC分化 注:マクロファージ分化プロトコルの概略的な要約を図1に示します。 細胞分化成長因子およびその他の試薬の調製 hESC-SFM メディアを準備します (前のセクションを参照)。 ゼラチンを滅菌水に溶解して、ブタゼラチンの0.1%w/v溶液を調製します。ゼラチン溶液は、最大2年間4°Cで保存することができます。 BMP4を4 mM塩化水素(HCl)-0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトBMP4ストック溶液(25μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブに50 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックBMP4は5日間4°Cで保存することができます。 VEGFを0.2%BSA PBS溶液に溶解させることにより、ヒトVEGFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液を10μLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックVEGFは7日間4°Cで保存することができます。 SCFを0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトSCFストック溶液(100μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブで5μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは、1年まで-20°Cで保存することができます。一度解凍すると、ストックSCFは10日間4°Cで保存することができます。 IL3を0.2%BSA PBS溶液に溶解させることで、ヒトIL3ストック溶液(10μg/mL)を調製します。株式溶液をクライオチューブに500 μLアリコートとして配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。 CSF1を0.2%BSA PBS溶液に溶解して、ヒトのCSF1ストック溶液(10μg/mL)を調製します。株式溶液を1 mLのアリコートとしてクライオチューブに配布します。ストックソリューションは-20°Cから2年まで保存できます。一度解凍すると、ストックSCFは15日間4°Cで保存することができます。 インターフェロンガンマ(IFNg)、インターロイキン4(IL4)、インターロイキン10(IL10)の10 μg/mLストック溶液を0.2%BSA PBS溶液に溶解して準備します。0.2%BSA PBS溶液に溶解して(100 U/mL)のストック溶液にリポ多糖(LPS)を調製します。各ストックソリューションを35 μLのアリコートとして分配します。-80°Cで2年まで保管してください。一度解凍すると、在庫は7日間4°Cで保存することができます。 ステージ1:胚体の生成(0日目~3日目) 0日目には、ステージ1メディアの2.25 mL(50 ng / mL BMP4、50 ng/ mL VEGF、および20 ng /mL SCFを補う)を超低い取り付け6ウェルプレートの2つの井戸に加えます。 iPSCの1つの80%コンフルエントウェルのメンテナンスメディアを、ステージ1メディアの1.5 mLで6ウェルプレートに交換します。 細胞通過ツールを使用してコロニーをカットし、切られたコロニーをピペットで超低添付ファイル6ウェルプレートの2つの井戸に移す(材料表を参照)。 2日目に、0.5 mLのhESC-SFM培地を使用して、サイトカインを50 ng/mL BMP4、50 ng/mL VEGF、および20 ng/mL SCFの最終濃度にします。注:IPSC コロニーは、エブ (図 2A)になります。 ステージ2:懸濁液中の造血細胞の出現 4日目には、ゼラチンを0.1%w/vで6ウェル組織培養プレートの4ウェルをコーティングし、少なくとも10分間インキュベートします。 ゼラチンを取り除き、ステージ2培地(X-VIVO15に100 ng / mL CSF1、25 ng/mL IL-3、2 mMグルタマックス、1%ペニシリンストレプトマイシン、0.055 mM 2メルカプトエタノールを添加) 形成されたEBを50 mL遠心管に集め、重力によって管の底に落ち着くようにします。慎重にメディアを吸引します。 ステージ 2 メディアの 2 mL で EJB を再中断します。 ステージ2媒体2.5mLを含むゼラチンコーティングウェルに10~15個のEB(15個以下)を送ります。 37°Cおよび5%CO2空気でインキュベー2 トする。 メッキされた EB のメディアを 3 ~ 4 日ごとに 2 ~ 3 週間変更します。 2~3週間後、EJBは非接着造血細胞を懸濁液に放出し始めます。注:この中断細胞放出期間は、細胞株によって異なる場合があり、また、細胞株に依存する。この懸濁液中の細胞は、収穫され、マクロファージに成熟させることができる(ステージ3を参照) (図2A)。 ステージ3:末端マクロファージ成熟 懸濁造造細胞を収集し、EBプレート上の培地(ステージ2培地)を補充します。 遠心分離機の懸濁液細胞を200xgで3分間用した。 g ステージ3培地中の懸濁液細胞を再懸濁(X-VIVO15は100 ng/mL CSF1、2 mMグルタマックス、および1%ペニシリンストレプトマイシンを補充した)。 プレートは、採取し、0.2 x 106細胞/mLの密度で未処理のプラスチック10センチメートル細菌グレードプレート(10 mL)またはコーティングされていない6ウェル組織培養プレート(3mL)に細胞を紡いだ。 ステージ 3 のメディアにセルを 9 ~ 11 日間保持し、5 日ごとにメディアを変更します。注:ステージ3のステップ3.4.1~3.4.5は3~4日ごとに繰り返し、元のEBプレートから最大3ヶ月間回収されたサスペンションセルを繰り返すことができます。 マクロファージ偏光 マクロファージをM(LPS+IFNg)表現型に活性化するには、LPS(最終濃度:100ng/mL)とIFNg(最終濃度:10 U/mL)で細胞を48時間刺激します。細胞をM(IL4)表現型に活性化するには、IL4(最終濃度:20 ng/mL)で細胞を刺激します。M(IL10)表現型に活性化するには、IL10(最終濃度:5 ng/mL)でマクロファージを刺激します。 4. iPSC由来マクロファージ品質管理チェック 血球細胞計でそれらを数えることによって、6ウェルプレートの6ウェルプレートあたりに産生される造血性懸濁液細胞の数を決定する。 前述のようにマクロファージ形態を評価する(例えば、市販キット染色)8,9.,9 前に述,べたように遺伝子発現解析およびフローサイトメトリーを用いてマクロファージ特異的マーカーおよび偏光マーカーの発現を検出する。 6ウェルプレートのマクロファージの1ウェルでフローサイトメトリー実験を行う場合、成熟培地を吸引して細胞を収穫し、2mLのPBSで洗浄し、室温(RT)で5分間の酵素フリー細胞解離緩衝液2mLでインキュベートする。ピペットは、マクロファージを取り外して収穫するために繰り返し上下します。 ヘマトサイトメーターを用いた細胞を数え、2%BSA、0.5 mMエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)-PBS溶液の80 μLで再懸濁します。 MACSヒューマンFCブロッカーの20 μLを追加します。 氷の上で20分間インキュベートし、光から守ります。 適切な体積の2%BSA、0.5 mM EDTA PBS溶液を加え、細胞濃度を1 x 106マクロファージ/mLにします。 2%BSAの100 μLの1×105細胞、対応する抗体を用いた0.5 mM EDTA PBS溶液(下記注を参照)を染色し、光から保護されたRTで15分間インキュベートします。 1xを2%BSA、0.5 mM EDTA PBSの少なくとも100 μLで洗浄してください。 2%BSA、0.5 mM EDTA PBSの200 μLで細胞を再懸濁します。 4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI、希釈1:1,000)を生死染料として加えます。インキュベート 3 分 フローサイトメトリー解析では、主要集団にゲートし、次に単一細胞を、次に生細胞に入れます。生細胞集団では、マクロファージ関連マーカー発現が明らかである(図3A)。注:抗体は、マクロファージを導出するために使用される各細胞株について慎重に滴定する必要があります。結果のセクションに示されている抗体は、材料表にあります。SFCi55由来マクロファージフローサイトメトリーアッセイの希釈因子も含まれています。 5. 高スループット食細胞性アッセイ iPSC由来マクロファージ(iPSC-DM)を収穫し、培地を吸引し、氷冷酵素フリー細胞解離バッファーを添加し、5分間インキュベートして、ピペット処理を繰り返してマクロファージを収集します。 プレート8 x 104 iPSC-DMは、イメージング組織培養グレード96ウェルプレート(例えば、セルキャリアウルトラ、パーキンエルマー)の少なくとも2日前に、ステージ3培地の200μLで高スループットイメージングを行う。 PBSの2 mLで1つのバイアルを再懸濁してpHrodoGreen Zymosan-Aバイオ粒子を調製(「溶液1」)。10 sのための渦液。 PBSビーズ懸濁液2 mLを、より多くのPBSで1:5(“溶液2”)で希釈します。 8 sのためのソニッケートソリューション2と10 s.の渦溶液4°Cでそれを保ちます。このソリューションは、ステップ 5.11 で使用されます。 メッキされたiPSC-DMのメディアを取り外し、PBSで洗います。 1:20希釈してHoechst 33342を含有するPBS溶液を使用してiPSC-DMを染色する。37°Cで20分間インキュベートします。 PBSで細胞を洗います。 深い赤血漿膜染色を含有するPBS溶液を用いた汚れは1:1,000希釈した(材料表参照)。37°Cで30分間インキュベートします。 PBSで細胞を洗います。 4°Cに保たれたビーズ溶液を100μLずつiPSC-DMの各ウェルに加えます。プレートはイメージングの準備が整いました。 高含有画像システムを用いてプレートを画像化し、ウェル全体で3つ以上のフィールドを取得し、ウェルの良好な表現を得る。 コロンバスソフトウェア(高コンテンツイメージング解析システムソフトウェア)を使用して食作用を定量化します。明確な画像バッチ分析のために、特定のアルゴリズムを開発できます。 青い強度を測定し、青信号が核を示すソフトウェアで定義します。 赤い強度を測定し、赤信号が細胞質を示していることをソフトウェアで定義します。 核と細胞質が一緒に細胞に対応することを定義します。 細胞内の緑色の強度を測定し、細胞を貪食と見なすために厳密なカットオフ/しきい値を確立します。 細胞毎の食細胞画分と平均食細胞指数を定量化する。ビーズの色の強度はビーズの数に比例するので、貪食活性は、摂取したビーズの数によって測定することができる。 アルゴリズム/パイプラインをすべてのフィールド内のすべての画像に適用し、取得したすべてのタイムポイントで、細胞の貪食能力を決定するための堅牢で公平なバッチアプローチを可能にします。注:コロンブスは、細胞のフェノタイピングと機能テストのための細胞セグメンテーション分析を提供する高内容分析ソフトウェアです。