cDNA的动力学交联和分析是一种允许以高时间分辨率研究活细胞中蛋白质-RNA相互作用动力学的方法。这里详细描述了该方案,包括酵母细胞的生长、UV交联、收获、蛋白质纯化和下一代测序文库的制备步骤。
RNA结合蛋白(RBP)与其RNA底物之间的相互作用表现出流动性和复杂性。在其生命周期内,单个RNA可以被许多不同的RBP结合,这些RBP将调节其产生,稳定性,活性和降解。因此,已经做了很多工作来理解这两种分子之间存在的动力学。一个特别重要的突破是“cross-l inink and immunoprecipitation”(CLIP)的出现。该技术允许严格研究哪些RNA与特定的RBP结合。简而言之,将感兴趣的蛋白质在体内与其RNA底物进行紫外交联,在高度严格的条件下纯化,然后将与蛋白质共价交联的RNA转化为cDNA文库并进行测序。自其概念以来,已经开发了许多衍生技术,以使CLIP适合特定的研究领域。然而,众所周知,使用紫外线进行交联效率低下。这导致暴露时间延长,使得RBP-RNA相互作用的时间研究变得不可能。为了克服这个问题,我们最近设计并制造了大大改进的紫外线照射和细胞收集设备。使用这些新工具,我们开发了一种以高时间分辨率对活细胞中的RBP-RNA相互作用进行时间分辨分析的方案:动力学CRoss-link和cDNA的Nalysis(χCRAC)。我们最近使用这种技术来研究酵母RBP在营养应激适应中的作用。本手稿详细介绍了χCRAC方法,并介绍了使用Nrd1 RBP获得的最新结果。
RNA通常依靠RBP来发挥其功能,这引起了人们对理解这些分子之间动力学的极大兴趣。已在多种生物体中鉴定出许多RBP。然而,在体内研究RBP-RNA相互作用一直是出了名的困难。研究这种相互作用的一个重大突破是CLIP1的出现。该方法利用紫外(UV,254 nm)照射诱导RBP与其直接结合的RNA之间的共价键(即零距离交联)。随后,在严格的条件下对感兴趣的RBP进行免疫纯化,以确保仅鉴定与蛋白质共价交联的RNA。结合的RNA然后用RNA酶部分消化,随后转化为cDNA文库进行测序。高纯化严格性非常重要,因为它大大提高了蛋白质和RNA回收率的特异性,通过交联核糖核蛋白(RNP)复合物的SDS-PAGE纯化也进一步增强了特异性。CLIP和相关方法还提供了对蛋白质结合位点的核苷酸分辨率洞察,因为在测序文库的制备过程中,与RNA交联的氨基酸经常终止逆转录酶或导致酶在该位点引入突变1,2,3。
自推出以来,最初的CLIP协议已经产生了各种各样的衍生方法。一个特别重要的突破来自HITS-CLIP(或CLIP-seq)的开发,它将高通量测序与CLIP方法3相结合。此后,所有基于CLIP的方法都采用了这种方法。iCLIP引入了RNase介导的修剪和衔接连接技术的改进,有助于更准确地映射RBP结合位点4。PAR-CLIP 将 4 硫代尿苷/尿嘧啶标记与 365 nm 的交联相结合,使得通过分析 T-C 取代物5 来绘制交联位点成为可能。CRAC、尿素-iCLIP、dCLIP和uvCLAP引入了变性条件和双重亲和纯化步骤,进一步减少了与亲和树脂的背景结合,并进一步提高了蛋白质捕获的特异性2,6,7,8,9。此外,CRAC、uvCLAP 和 dCLIP 引入了用亲和标签标记感兴趣的 RBP,从而克服了产生特异性抗体的需要。
还进行了一些优化以加快 CLIP 方法。最初的CLIP协议利用捕获的RNA的放射性标记,以便在SDS-PAGE之后可视化RBP-RNA复合物。然而,对于没有为此类工作设立的实验室来说,使用放射性可能会有问题。irCLIP包含一个荧光团偶联接头,可通过红外成像10 进行可视化,sCLIP利用捕获的RNA的生物素化,以便通过链霉亲和素偶联的HRP11对其进行可视化。此外,eCLIP完全放弃了RNA标记;相反,仅根据其已知的大小12切除蛋白质。基于链霉亲和素的纯化也已用于加速FAST-iCLIP中的文库制备过程,其中生物素化的3’接头连接到RNA上,并用于在逆转录和环化后实现纯化13。iCLIP协议的其他增强功能也大大增加了库的复杂性4.
最后,对CLIP进行了修改,以便能够从不同的细胞亚区室14,15捕获RBP,使用可光活化核糖核苷5,16,17的脉冲诱导可视化新转录的RNA,捕获甲基化RNA18,19,20,检查RNA-RNA相互作用21,22,并映射3’末端23,24.
尽管基于CLIP的技术在帮助我们理解RBP和RNA之间的相互作用方面做出了巨大贡献,但它一直受到UV交联效率低下的限制。尽管在单层中生长的培养细胞通常相对容易交联,但这在组织或溶液中的细胞中更具挑战性。组织可能需要多轮紫外线照射才能渗透到所需的细胞层,而微生物细胞通常在含有芳香族紫外线吸收化合物的丰富培养基中生长25。事实上,长达 30 分钟的紫外线照射时间已被用于在此类样品的 RBP 与其结合的 RNA 之间产生足够的交联26,27,28。这种延长的紫外线照射会在细胞内诱导应激反应,例如紫外线诱导的DNA损伤,这可能会污染某些应用中的最终数据。
大多数CLIP研究都集中在生成细胞中特定蛋白质 – RNA相互作用的单个“快照”。然而,蛋白质-RNA相互作用本质上是动态的,特别是当细胞受到环境变化的影响时。这可能包括必需营养素的可用性突然减少或温度的快速变化。因此,要真正了解RBP在压力下的作用,最好进行时间分辨分析,因为它们可以捕获压力期间RBP目标的全部范围,并确定所选RBP在压力反应的哪个阶段处于活动状态。特别是,对酵母的研究表明,适应的最初几分钟对生存绝对至关重要,细菌中的RNA半衰期可以从几分钟到几秒钟不等29,30,31,32,33。因此,理想情况下,这种时间分辨分析应该在高时间分辨率下进行。然而,较长的交联时间使得早期适应性反应的研究特别具有挑战性。
为了克服这些问题,我们最近开发了一种改进的方法,能够在长达一分钟的时间尺度上交联和收获细胞。我们的χCRAC方法允许以以前未见过的分辨率定量测量RBP-RNA相互作用的动态变化。该方法的关键是开发了一种新型紫外线照射装置32 ,该装置将酵母和溶液中细菌中所需的交联时间减少了约10倍,有效地瞬间冷冻RBP-RNA相互作用。此外,为了在紫外线照射后快速收获细胞,我们开发了一种真空过滤装置,可以在大约 30 秒32 的 0.5 L 培养物中收获指数生长的酵母。这些技术创新允许以分钟级分辨率研究RBP-RNA动力学。此外,我们还对原始CRAC协议2 进行了一些优化,以提高其实用性。
使用χCRAC,我们最近研究了酵母核RBP,Nab3的靶组,以响应葡萄糖剥夺。在 酿酒酵母中,Nab3可以与Nrd1,RBP和RNA解旋酶Sen1形成复合物,形成NNS复合物。NNS与RNA聚合酶和新生转录本结合可以触发转录终止34。这种复合物主要参与去除神秘的非编码RNA转录本,但也已被证明可以调节蛋白质编码基因的表达。该研究显示,Nab3在仅一分钟的应激后就对非编码和编码转录本的靶向不同32。我们证明了Nab3的共转录终止导致逆转录转座子基因的非常短暂的脉冲样表达,这很难使用传统的基于CLIP的方法检测到。此外,我们的紫外交联剂中较短的紫外照射时间也显著提高了短寿命非编码RNA的回收率32。χCRAC可能是一个关键工具,不仅可以阐明RBP如何在即时时间尺度上塑造对压力的反应,还可以阐明它们在响应的整个生命周期中不断变化的角色。这份手稿详细概述了χCRAC协议中的所有步骤。出于说明目的,该方法用于研究参与转录终止和RNA衰变35,36的酵母Nrd1蛋白及其RNA靶蛋白在多个时间点响应葡萄糖剥夺。最后,我们还证明,我们的紫外线照射单元可以快速将RBP与HeLa细胞中的RNA交联,从而可以在贴壁细胞中进行高分辨率的时间分辨分析。
χCRAC方法与新的交联和细胞收获装置相结合,具有巨大的潜力,因为它适用于广泛的模式生物,因此应该引起RNA领域的普遍兴趣。χCRAC 可用于许多领域。例如,该方法可用于测量蛋白质成大分子复合物的分层组装,例如剪接体和核糖体,这通常涉及蛋白质和RNA分子之间的动态相互作用。我们现在还经常使用它来监测当细胞受到各种压力时RNA衰变因子与其底物之间的相互作用。这使我们能够确定这些因素在适应性反应的哪个阶段最活跃,它们与哪些底物结合,以及这些相互作用的动态性。这些数据应使研究人员能够确定每个因素在适应环境变化方面的相对贡献。
χCRAC 使用双亲和纯化标签(HTF 或 HTP)在高度严格和变性的条件下纯化蛋白质。这确保了共纯化的RNA对于与目标蛋白共价交联的RNA具有高度富集性。但是,依赖亲和力标记有缺点。例如,标签可能会干扰蛋白质功能,这可能会使其RNA结合相互作用组的读数失真。此外,对于某些模式生物,可能并不总是能够利用标签,因为尚未获得将DNA片段整合到基因组中或转化表达质粒的遗传工具。然而,改变χCRAC方案的某些部分以使其与依赖抗体纯化RBP的基于CLIP的方案兼容是很简单的。事实上,这项研究表明,可以将基于iCLIP的纯化与我们的交联剂相结合。我们现在正在开发CLIP协议,以研究人类RNA结合蛋白与新生RNA转录本的时间关联。
当对新蛋白质进行χCRAC时,必须优化紫外线照射以诱导最大的交联。这一点很重要,因为高紫外线照射会降低纯化步骤中RNA的回收率。表达重组RBP的细胞暴露于各种紫外线剂量,100 mJ / cm 2,250 mJ / cm 2,500 mJ / cm 2和1 J/ cm 2。然后捕获RNP,并对RNA片段化和放射性标记。之后,通过SDS-PAGE解析RNP,并进行放射自显影,以推断哪种暴露产生最强烈的信号(即最大交联)。
一旦实验条件得到优化,建议在进行χCRAC时进行几个对照实验。首先,可以使用紫外线照射的未标记样品来监测与纯化微球的背景结合。其次,当在转移实验期间应用χCRAC时,细胞移回原始培养基的第二个时间序列可以研究细胞本身的过滤是否诱导RNA水平或蛋白质 – RNA相互作用的变化。
如引言所述,最近发表的许多论文提出了对CLIP协议的一些优化。这包括使用荧光标记的适配器通过红外扫描10 检测蛋白质-RNA复合物,以及对各种核酸纯化和大小选择步骤的优化,以增加所得文库的复杂性12,45。我们目前正在实施其中一些改进,以进一步完善χCRAC协议。这里介绍的协议已经包含对原始CRAC和χCRAC协议的许多改进,这些改进增加了数据的复杂性。例如,以前,在分离SDS-PAGE凝胶上的交联放射性蛋白质-RNA复合物后,将它们转移到硝酸纤维素膜上,并从印迹中分离交联RNA。然而,RNP的转移和随后的RNA提取可能非常低效,特别是在处理大RBP如RNA聚合酶亚基时。这可能导致交联RNA的回收率显着降低。在当前方案中,交联RNA直接从SDS-PAGE凝胶切片中提取,如图 1所示。这增加了交联RNA的回收率。此外,在cDNA的PCR扩增后,产物最初在3%的低熔解温度琼脂糖凝胶上分离,然后从凝胶中提取175-300 bp PCR产物。然而,这些凝胶很容易过载,导致DNA分离非常差。用预制TBE凝胶代替琼脂糖凝胶可实现更一致的尺寸分离和更好的PCR产物回收率。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了威康信托基金会(091549给S.G.和109093/Z/15 / A给S.M.),威康信托基金会细胞生物学中心核心资助(092076)和医学研究委员会非临床高级研究奖学金(MR / R008205 / 1到S.G.),欧洲分子生物学组织的长期博士后奖学金(ALTF 1070-2017到R.A.C.)的资助, 以及丹麦独立研究基金(T.H.J)。
1,4-dithioreitol | Merck | 10708984001 | Buffer component in mammalian cell lysis |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | General reaction tube |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | For holding columns and collection of waste |
32P-yATP | Perkin Elmer | NEG502Z-250 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
4-12% Bis-Tris gel | Invitrogen | NP0321BOX | SDS-PAGE gel |
4X loading buffer | Novex | NP0008 | Protein loading dye concentrate |
50 bp ladder | New England Biolabs | N3236 | Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library |
50% PEG | NEB | B100045 | For the L5 linker ligation |
6% TBE gel | Invitrogen | EC6265BOX | For separation and purification of the cDNA library |
Acetone | ACROS Organics | 423245000 | Washing of TCA-precipitated proteins |
anti-FLAG beads | Sigma Aldrich | M8823-1ML | For purifcation of FLAG-tagged RBPs |
ATP (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0441 | For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs |
Beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | Buffer component |
Biomax MS intensifying screen | Sigma Aldrich | Z363162-1EA | For intensifying the autoradiogram signal |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | 1010219 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | For inhibition of cellular proteases after lysis |
Complete supplement mixture -TRP | Formedium | DCS0149 | For preparation of synthetic defined medium |
Costar Spin-X 0.22 µm filters | Sigma Aldrich | CLS8160 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
DNase RQ1 | Promega | M6101 | For DNA digest following cell lysis |
dNTPs (10 mM) | Sigma Aldrich | 4638956001 | For reverse transcription and PCR |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10041814 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen | AM9261 | For protease K buffer |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293 | For degradation of primers following PCR |
Glass microfiber filters | Whatman | 1823-010 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
Glucose | Formedium | GLU03 | For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium |
Glycogen (20 mg/mL) | Roche | 10901393001 | Precipitation of proteins, RNA and DNA |
GST-TEV | Homemade | Construct and purification protocol is available upon request | |
Guanidium hydrochloroide | Thermo Fisher Scientific | 10071503 | Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer |
IgG beads | GE Healthcare | 17-0969-01 | For purification of protein A-tagged RBPs |
Imidazole | Sigma Aldrich | I2399-100G | For elution of captured proteins from Nickel beads |
Isoamyl alcohol | Thermo Fisher Scientific | A393-500 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Luna Universal One-Step RT-qPCR | NEB | E3005S | For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles |
Magnesium chloride | Fluka Analytical | 63020-1L | For PNK buffer |
Membrane filters | Millipore | AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria | For vacuum filtration of cells |
Micro bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | For collecting eluate after gel extraction |
Ni-NTA beads | Qiagen | 30210 | For secondary protein capture |
NP-40 | Sigma Aldrich | I8896-100ML | Buffer component |
Pfu polymerase | Promega | M7741 | For amplification of the cDNA library |
Phenol | Sigma Aldrich | P4682-400ML | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Pierce spin columns | Thermo Fisher Scientific | 69725 | For on-column enzymatic reactions |
Protease K | Roche | 3115887001 | For degradation of the RBP following gel extraction |
Quartz Petri dish | UVO3 | N/A | For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP |
Radiography films | Amersham | 28906843 | For autoradiography visualisation |
RNAClean XP beads | Beckmann | A63987 | SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs |
RNase H | New England Biolabs | M0297 | For degradation of RNAs following reverse transcription |
RNase-It | Agilent | 400720 | For RNA digestion |
rRNasin | Promega | N2511 | For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889-1KG | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | Buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-100G | Buffer component in mammalian cell lysis |
Sodium dodecylsulfate | Sigma Aldrich | L3771-1KG | For protease K buffer |
SUPERase-In | Invitrogen | AM2694 | For inhibition of cellular RNases after lysis |
SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | For reverse transcription |
T4 PNK | New England Biolabs | M0201 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204 | For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end |
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q | NEB | M0351S | For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs |
TBE buffer (10X) | Invitrogen | 15581-028 | For running TBE gels |
TEV protease | Homemade | For eluting captured proteins following FLAG capture | |
Thermosensitive alkaline phosphatase | Promega | M9910 | For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs |
Trichloroacetic acid (100%) | Sigma Aldrich | T0699-100ML | For precipitation of RBP-RNA complexes |
Tris hydrochloride | Invitrogen | 15504-020 | Buffer component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Buffer component in mammalian cell lysis |
Vari Filter | UVO3 | N/A | Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP |
Vari-X-Linker | UVO3 | N/A | Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP |
Yeast nitrogen base | Formedium | CYN0410 | For preparation of synthetic defined medium |
Zirconia beads | Thistle | 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria | For cell lysis via bead beating |