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发育生物学

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Published: March 04, 2020
doi:
10.3791/60927
, ,
1Department of Animal Science,Rutgers University

Summary

Qui, descriviamo l’immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell’RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L’allevamento strategico e un’attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Abstract

Quantificare le differenze nell’abbondanza di mRNA è un approccio classico per comprendere l’impatto di una determinata mutazione genica sulla fisiologia cellulare. Tuttavia, caratterizzare le differenze nel translatoma (l’intero mRNA tradotto) fornisce un ulteriore strato di informazioni particolarmente utile quando si cerca di comprendere la funzione della regolazione dell’RNA o del legame delle proteine. Sono stati sviluppati diversi metodi per realizzarlo, tra cui la profilazione dei ribosomi e l’analisi dei polisome. Tuttavia, entrambi i metodi comportano notevoli sfide tecniche e non possono essere applicati a specifiche popolazioni di cellule all’interno di un tessuto a meno che non siano combinati con metodi di selezione aggiuntivi. Al contrario, il metodo RiboTag è un’alternativa genetica, efficiente e tecnicamente semplice che consente l’identificazione di RNA associati al ribosoma da specifiche popolazioni cellulari senza ulteriori passaggi di ordinamento, a condizione che sia disponibile un driver Cre specifico per le cellule applicabile. Questo metodo consiste nell’allevamento per generare i modelli genetici, la raccolta dei campioni, l’immunoprecipitazioni e le analisi dell’RNA a valle. Qui, illustreremo questo processo nelle cellule germinali maschili adulte mutanti per una proteina legante all’RNA necessaria per la fertilità maschile. Particolare attenzione è rivolta alle considerazioni per l’allevamento, con particolare attenzione alla gestione efficiente delle conotee e alla generazione di corretta comunità genetiche e immunoprecipitazioni al fine di ridurre lo sfondo e ottimizzare la produzione. È inclusa anche la discussione sulle opzioni di risoluzione dei problemi, ulteriori esperimenti di conferma e potenziali applicazioni a valle. Gli strumenti genetici presentati e i protocolli molecolari rappresentano un modo efficace per descrivere gli RNA associati al ribosoma di specifiche popolazioni cellulari in tessuti complessi o in sistemi con stoccaggio e traduzione di mRNA aberranti con l’obiettivo di informare sui driver molecolari dei fenotipi mutanti.

Introduction

L’analisi dell’abbondanza di RNA di una cellula o di tessuto, come esaminato da microarray o sequenziamento dell’RNA, si è dimostrato un potente strumento per comprendere i driver molecolari dei fenotipi mutanti. Tuttavia, questi strumenti di analisi relativamente incompleti potrebbero non informare sulla fisiologia o sul proteoma della cellula, specialmente nei sistemi in cui molti mRNA sono immagazzinati prima della traduzione come cellule neurali e germinali. In questi sistemi, la definizione della popolazione di mRNA tradotti attivamente in proteina, o il translatoma della cellula, può essere un indicatore migliore dello stato fisiologico effettivo della cellula1,2. Ad esempio, le cellule germinali in varie fasi dello sviluppo trascrivono gli RNA che vengono memorizzati per una traduzione successiva, guidati dallo sviluppo3 o dai segnali di segnalazione4. Questo processo è esemplificato dai protamini di codifica mRNA, in cui la trascrizione dell’mRNA è rilevabile giorni prima che la proteina sia fatta1,2,5,6. Allo stesso modo, le cellule neurali trascrivono l’RNA nel nucleo e lo trasportano lungo l’assone, come nel caso di actina7. Oltre a questi sistemi cellulari specializzati, è improbabile che i trascrittomi a stato costante siano informativi nei modelli in cui l’immagazzinamento di RNA, la biogenesi del ribosoma o la traduzione di mRNA sono influenzati. Molti altri fattori possono anche avere un impatto sul pool di RNA a stato costante di una cellula, tra cui il decadimento dell’mRNA e l’attività delle proteine che legano l’RNA. In questi casi, strumenti robusti per analizzare RNA o mRNA associati a ribosomi in traduzione attiva hanno maggiori probabilità di produrre risultati biologicamente rilevanti.

A tal fine, sono stati sviluppati diversi metodi per identificare i messaggi associati ai ribosomi o attivamente tradotti. La profilazione polisomica, che fornisce un’istantanea delle trascrizioni associate al ribosoma, è stata utilizzata per molti decenni per isolare gli RNA intatti associati a sottounità ribosomiche o complessi mono, di- e poli-ribosomi3. In breve, i listi delle cellule raccolte vengono applicati a un gradiente di saccarosio lineare e centrifugati come alta velocità, con conseguente separazione delle sottounità ribosomiche, ribosomi intatti e polinomi per dimensione. Tradizionalmente, questa tecnica è stata applicata per studiare uno o pochi mRNA, ma recentemente questo metodo è stato combinato con studi RNA-seq per chiarire la funzione dei potenziali regolatori traslazionali8,9 Mentre un modo potente per distinguere tra mRNA attivamente traduttori e non traducibili10, la profilazione polisomica richiede metodi che richiedono tempo (frazione di gradiente e ultracentricoltura) e può richiedere una buona dose di campioni che effettuano l’analisi delle rare cellule. popolazioni impegnative.

Un approccio alternativo all’esame del translatome è la profilazione dei ribosomi, che identifica le porzioni di trascrizioni direttamente associate al ribosoma. In breve, i frammenti di RNA associati ai ribosomi vengono generati tramite il saggio di protezione di RNase, i singoli complessi ribosomi separati tramite gradiente di saccarosio e frammenti di RNA associati isolati e convertiti in tag RNA-seq suscettibili al sequenziamento profondo11. Uno dei principali vantaggi della profilazione del ribosoma è la capacità di determinare le posizioni specifiche dei ribosomi al momento dell’isolamento che consente l’identificazione dei siti di inizio della traduzione, il calcolo dell’occupazione e della distribuzione ribosomica e l’identificazione delle bancarelle di ribosomi12. Tuttavia, questo metodo ha diversi inconvenienti intrinseci, tra cui le esigenze di apparecchiature (frazionatore di gradiente e ultracentrifuga), un protocollo relativamente complesso che richiedono un’ampia risoluzione dei problemi e problemi di calcolo non facilmente gestiti dall’utente inesperto11. È importante sottolineare che la profilazione del ribosoma viene applicata principalmente alle cellule isolate nella coltura e richiede materiale sostanziale, rendendo limitata la sua applicazione a tessuti misti di tipo cellulare o a cellule ordinate in vivo.

Il metodo RiboTag dei mammiferi, sviluppato da Sanz ealtri nel 200913,elimina una serie di problemi inerenti al profilazione sia polisomico che a ribosoma. In questo metodo, gli RNA associati ai ribosomi possono essere isolati da tipi di cellule specifici, consentendo l’analisi di translatomi specifici di tipo cellulare in tessuti complessi senza tecniche di isolamento aggiuntive e attrezzature specializzate, come è necessario in altri metodi13,14. La base del metodo RiboTag è un modello di topo transgenico (RiboTag) che trasporta un locus modificato per il gene di proteina della sottounità ricorporea 60S Rpl22. Questo locus (Rpl22-HA) include un eson terminale dissate seguito da una copia aggiuntiva dell’eson del terminale modificato per includere un tag ha-terminale hemagglutinin (HA) del terminale C all’interno della regione di codifica. Quando viene attraversato a un mouse che esprime una Ricombinasi di creme specifiche della cella, l’esone scisso viene rimosso consentendo l’espressione di RPL22 con tag HA in modo specifico della cella (Figura 1). Il tag HA può quindi essere utilizzato per immunoprecipitare ribosomi (IP) e i loro RNA associati dal tipo di cella selezionato.

Oltre alla pubblicazione iniziale che ha sviluppato la tecnica, diversi altri laboratori hanno utilizzato il modello RiboTag. Tessuti diversi come le cellule di topo Sertoli e Leydig15, microglia16, neuroni17,18, ovociti19, e cellule coltivate20 sono stati profilati e studiati. Anche se questo protocollo è chiaramente in grado di isolare con successo i ribosomi e gli RNA associati in diversi tipi di tessuto ci sono ancora aree che necessitano di miglioramento, soprattutto quando applicato ai sistemi mutanti. In particolare, la comune dipendenza dai tessuti freschi comporta una maggiore variazione tecnica che può ridurre notevolmente la potenza dell’analisi. In secondo luogo, l’identificazione sicura degli obiettivi tradotti in modo differenziale è resa più difficile quando si verifica un elevato background di immunoprecipitazioni da tipi di cellule ricombinate nonCre, come precedentementeriportato 13. Mentre Sanz ealtri ha progettato la premessa di base della tecnica, in questo manoscritto il laboratorio Snyder presenta l’ottimizzazione del protocollo per ridurre queste preoccupazioni, rendendo il metodo più pratico ed efficiente.

Lo scopo di questo articolo è quello di spiegare i passaggi per l’allevamento di topi che esprimono ribosomi con etichetta ha specifici per le cellule, immunoprecipitando questi ribosomi da campioni congelati da flash e purificando i loro RNA associati per ulteriori analisi a valle. Poiché la cellula germinale maschile dei mammiferi e la mutazione dell’infertilità studiata forniscono sfide uniche, sono stati fatti sforzi per illuminare i modi in cui questa tecnica può essere adattata ad altri sistemi cellulari.

Protocol

Tutte le pratiche di uso e movimentazione degli animali sono state approvate dal Comitato interno per la cura e l’uso degli animali della Rutgers University (IACUC). 1. Allevamento di topi Allevare topi femminili omozygous per una mutazione della proteina legante all’RNA che porta all’infertilità maschile (manoscritto in preparazione, indicato qui come il gene di interesse) in trio accoppiamenti ai maschi emizygous per l’allele Stra8-iCre (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre) , poiché l’abbinamento di due femmine a ogni maschio aumenta l’efficienzariproduttiva.NOTA: Il gene mutante di interesse (M) è stato passato eternamente, poiché le femmine omozigose per M hanno una fertilità normale. Questo ha l’ulteriore vantaggio di consentire la trasmissione paterna della cellula germinale maschile Cre (hemizygous), come raccomandato21 e ottimizzare la percentuale di prole con la combinazione allelica desiderata. Poiché omozygous Cres presentano tossicità delle cellule germinali22, si raccomanda che l’allele sia mantenuto e passato in uno stato etetozigolo o emizigoto. È importante sottolineare che l’espressione Cre non deve co-verificarsi con l’allele Rpl22-HA fino alla popolazione sperimentale. Il mancato isolamento dell’alletale Rpl22-HA da Cre negli animali da riproduzione si tradurrà in prole che a livello globale esprimono Rpl22-HA a causa dell’attività della creta delle cellule germinali. Questo problema è specifico per la cellula germinale. Inoltre, il Stra8-iCre è specifico per la popolazione cellulare degli autori di interesse22, mirando alle cellule che scendono e molto presto nella meiosi, compresi i preleptotene e i leptotene. È invece possibile utilizzare un driver Cre diverso specifico per un altro tipo di cella di interesse. La pratica comune impone che la cellula germinale maschile abbia espresso che Cres sia trasmessa sul lato paterno. Tuttavia, è possibile trasmissione materna dello Stra8-iCre si tradurrà in un’espressione transgenica simile nella prole maschile. Indipendentemente dallo schema di allevamento selezionato, al fine di generare prole con espressione Cre equivalente, tutti i campioni sperimentali devono essere generati tramite trasmissione Cre dallo stesso lato parentale (sempre materno o sempre paterno). Cuccioli maschi di genere, come descritto nella sezione 2.4. Selezionare quelli che portano l’allele M e positivi per Cre ()per l’allevamento a valle. Allevare topi femminili homozygous per l’allele M in accoppiamenti trio ai maschi omozygous per Rpl22-HA (B6J.129 (Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ).NOTA: Lo sfondo Rpl22-HA è altamente miscelato, quindi è necessario prestare attenzione quando si valutano fenotipi specifici del ceppo. Genotipo risultante cuccioli femminili per identificare quelli che portano l’allele M e positivo per Rpl22-HA (S/M:Rpl22-HA) (vedere la sezione 2.3). Selezionare queste femmine per l’allevamento a valle. Incrocia i maschi con le femmine di trio con le femmine di trio con le femmine di z/M:Rpl22. Genota i cuccioli risultanti (vedi le sezioni 2.3 e 2.4) per identificare i maschi che sono sia Cre e Rpl22 e wildtype o M/M.NOTA: Poiché questo lavoro si concentra su una mutazione che comporta una completa infertilità maschile, sono state prese considerazioni speciali nello schema di allevamento per ottenere in modo più efficiente i genotipi sperimentali desiderati. Tali considerazioni potrebbero non essere necessarie in altri modelli sperimentali. Vedere Figura 2 per uno schema di allevamento completo e la legenda di accompagnamento per ulteriori informazioni sulle considerazioni di allevamento. 2. Raccolta di campioni Raccogliere testicoli da topi maschi a 21 giorni post-partum (dpp). Tonelli sacrificati per inalazione di CO2 seguiti da lussazione cervicale. Fare un’incisione ventrale (3 cm) su ogni animale fiancheggiato da due più brevi (2 cm ciascuno), incisioni laterali collegate. Tirare la pelle e peritoneo indietro per rivelare i testicoli. Usando le pinze, tira il cuscinetto di grasso epidymal da un lato della cavità del corpo per rivelare l’epididymis e il testis. Con le forbici tenotomiche, accise i testicoli, avendo cura di tagliare via epididymis, grasso circostante, e qualsiasi vascolatura esterna. Mettere i testicoli intatti in un tubo pulito da 1,7 mL. Ripetere con l’altro lato, aggiungendo i secondi testicoli al primo tubo. Far rotolare questo tubo e immergerlo immediatamente in azoto liquido per congelare.NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi fino all’uso. Raccogliere campioni di punta di coda aggiuntivi per ogni animale (2 mm) per la conferma della genotipizzazione. Per estrarre il DNA, aggiungere 100 o L di 50 mM NaOH a una punta di coda di 2 mL in un tubo da 1,7 mL e far bollire a 95 gradi centigradi per 30 min. Conservare il supernatante (contenente il DNA genomico) e conservare il DNA estratto a 4 gradi centigradi come modello per le seguenti reazioni di genotipizzazione. Eseguire la genotipizzazione Rpl22-HA seguendo un metodo adattato da Sanz et al.13 utilizzando i seguenti primer: in avanti: 5′ GGGAGGCTGCTGGATG 3′; inverso: 5′ TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3′. Preparare una miscela di reazione composta da 2 oL di DNA come estratto al passo 2.2.1, 0,08 L di 25 mM dNTP, 0,1 l da 10 mM di primer in avanti, 0,1 l di 10 mM 2 – L di un buffer di reazione a catena di polimerasi (PCR) (650 mM Tris pH – 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2e 0,1% Tween), 0,2 l di polimerasi Taq e nuclease-free H2O per un volume totale di 20 . Utilizzare le seguenti condizioni di termociclista: una fase di fusione del primer di 30 s a 95 gradi centigradi, 30 s anneal a 64 gradi centigradi e una allungamento di 30 s a 72 gradi centigradi, ripetuta 37 volte con un’allungamento finale di 5 min a 72 gradi centigradi.NOTA: Ciò ha prodotto una dimensione del prodotto di 260 bp per i campioni wildtype e 292 bp per i campioni che sono stati Rpl22-HA Eseguire la genotipizzazione Cre utilizzando i seguenti primer: in avanti: 5′ GTGCCAGCTGAACAACAGGA 3′; inverso: 5′ AGGGACACAGCATTGGAGTC 3′. Preparare la reazione PCR come descritto nel passaggio 2.3.2 utilizzando invece i primer Cre . Utilizzare le seguenti condizioni di termociclista: una fase di fusione del primer di 30 s a 95 gradi centigradi, 30 s anneal a 60 s e una allungamento di 15 s a 72 gradi centigradi, ripetuta 35 volte con un’allungamento finale di 5 min a 72 gradi centigradi. Eseguire il gene della genotipizzazione degli interessi come standard per il gene in questione.NOTA: il protocollo di genotipizzazione dell’autore utilizza un Taqpersonalizzato concentrato e, come tale, altri utenti potrebbero dover modificare le condizioni in base alle proprie esigenze enzimatiche. Al fine di comprendere meglio l’impatto di questo gene di interesse sulla perdita sulla traduzione, i maschi che erano wildtype o omozygous per l’allele mutante di interesse e che erano anche Cre e Rpl22 sono stati selezionati per essere i campioni sperimentali. La selezione del genotipo è ulteriormente descritta in precedenza nella sezione 1. 3. Preparazione delle soluzioni NOTA: la preparazione delle soluzioni e di tutti i passaggi successivi deve essere eseguita in condizioni rigorose. Per preparare il buffer di omogeneizzazione (HB), aggiungere 2,5 mL di 1 M Tris pH 7,4, 5 mL di 1 M KCl, 600 L di 1 M MgCl2e 500 L di NP-40 a un tubo da 50 mL. Portare in volume (50 mL) in pirocarbonato dietileo (DEPC) H2O e mescolare fino a quando tutti i componenti sono incorporati.NOTA: Le concentrazioni finali saranno le seguenti: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mMM KCl, 12 mM MgCl2e 1% NP-40. Per preparare il buffer di lavaggio ad alto contenuto di sale (HSWB), aggiungere 2,5 mL di 1 M Tris pH 7,4, 15 mL di 1 M KCl, 600 L di 1 M MgCl2e 500 – L di NP-40 a un tubo da 50 mL. Portare su volume (50 mL) in DEPC H2O e mescolare fino a quando tutti i componenti sono incorporati.NOTA: Le concentrazioni finali saranno le seguenti: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mMM KCl, 12 mM MgCl2e 1% NP-40Il protocollo può essere messo in pausa qui e le soluzioni possono essere memorizzate a temperatura ambiente fino all’uso. 4. Preparazione dei tessuti Prepesano tutti i tubi campione, il peso di registrazione e precool in azoto liquido. Precool malta sterile, pestello, e spatola di pesatura su ghiaccio secco. Macinare campioni di tessuto congelati flash in una polvere fine utilizzando un mortaio preraffreddato e sterile e pestello sul ghiaccio secco. Mettere il flash del tessuto congelato nel mortaio preraffreddato sul ghiaccio secco. Rompere delicatamente il tessuto in grandi pezzi utilizzando pestello e macinare lentamente fino a quando il tessuto è una polvere fine.NOTA: Anche se i tessuti freschi possono anche essere utilizzati, come per il protocollo originale13, nessuna differenza significativa nel risultato si osserva con l’uso di tessuti congelati flash. Per informazioni dettagliate, vedere Risultati e discussioni dei rappresentanti. Trasferire con attenzione il campione di terra nel tubo di raccolta preraffreddato raschiando la polvere dalla malta utilizzando una spatola preraffreddata. Assicurarsi che venga raccolto solo il tessuto e non l’umidità depositata sul mortaio freddo. Pesare il tubo con il tessuto, avendo cura di tenere il ghiaccio secco quando possibile. Calcolare la massa del tessuto sottraendo il peso iniziale del tubo dal peso del tubo con il campione in esso. Registrare questo valore per il calcolo successivo dei volumi del buffer di lisi.NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui, e i campioni possono essere memorizzati a -80 gradi centigradi fino all’uso. 5. Omogeneizzazione del campione Preparare il buffer di lisi (10 mL HB e integratori) aggiungendo 10 -L di 1 M dithiothreitol (DTT), 1 compressa inibitore proteasi, 50 l l di inibitore di RNase (40.000 unità/mL), 200 ll di 5 mg/mL cicloxeximide e 100 L di 100 mg/mL di eparina a 10 mL di HB. Mescolare fino a quando tutti i componenti sono incorporati e tenere sul ghiaccio fino all’uso.NOTA: Le concentrazioni finali degli integratori in 10 mL HB saranno le seguenti: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase inhibitor, 100 cycloheximide e 1 mg/mL di eparina. Questa soluzione deve essere utilizzata entro 24 h dell’aggiunta dei supplementi e può essere conservata a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio fino all’uso. Per ogni 100 mg di campione, aggiungere 1 mL di buffer di lisi. Con la stessa pipetta utilizzata per aggiungere il buffer di lisi, pipette attentamente il lisate risultante su e giù per frammentare le cellule e mescolare. Continuare a pipettare fino a quando il campione non è più viscoso, generalmente 25-30 colpi.NOTA: Poiché la soluzione è molto viscosa in un primo momento, una pipetta di grande diametro deve essere utilizzato per mescolare la soluzione. Una norma di 1000 L è normalmente sufficiente per 100 mg di tessuto. Mettere i campioni sul ghiaccio per 10 min alla liscivia. Quindi, far girare i campioni in una centrifuga preraffreddata (4 gradi centigradi) per 10 min a 10.000 x g. Un grande, sciolto, pellet torbida dovrebbe formarsi nella parte inferiore del tubo. Facendo attenzione a non disturbare il pellet, raccogliere il lisato in un nuovo tubo e registrare il volume per ogni campione. Per evitare la sgrezione del campione, assicurarsi che i campioni rimangano freschi per tutto il protocollo rimanente, conservandoli sul ghiaccio o a 4 gradi quando possibile. 6. Equilibration di perline Utilizzando il volume del lisato dal punto 5.2, calcolare il volume richiesto di perline magnetiche accoppiate alla proteina legante anticorpo appropriato (in questo caso, proteina G). Per 1 mL di lisato, utilizzare 375 l di proteine G perline (30 mg/mL).NOTA: La scelta delle perline coniugate varierà con l’anticorpo anti-HA utilizzato; ad esempio, se viene selezionato un anticorpo anti-HA generato dal coniglio, le perle proteiche A saranno preferibili. Utilizzando un rack di tubi magnetici, rimuovere il solvente perline e aggiungere un volume uguale di tampone di lisi fresca alle perline. Ruotare di 5 min a 4 gradi centigradi per lavarsi. Eseguire tutte le fasi di rotazione utilizzando un ruoteno tubo panca impostato su 20 rpm. Posizionare il tubo sul rack del tubo magnetico e rimuovere il tampone di lavaggio. Ripetere i passaggi 6.1-6.3 altre due volte. Aggiungere il buffer di lisi sul volume originale equilibrato perle. Conservare a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio fino all’uso. 7. Campione di preclearing Aggiungere 50 ll di perline equilibrate per ogni 1 mL di lisa to supernatante del campione lisminato (lisato) e ruotare a 4 gradi centigradi per 1 h. Posizionare il tubo sul rack magnete e raccogliere il lisato in un tubo fresco. Scartare le perline usate. Al lisa aggiungere 25 gradi luna di perline equilibrate per ogni 1 mL e ruotare a 4 gradi centigradi per 1 h. Conservare le perline G proteiche rimanenti a 4 gradi durante la notte. Posizionare il tubo sul rack magnete e raccogliere illisato in un tubo fresco. Scartare le perline usate. Dal lisato autorizzato, mantenere 50 L per agire come controllo di input campione. Conservare a -80 gradi centigradi.NOTA: Il campione di input funge da controllo che rappresenta la popolazione totale di RNA del campione, inclusi gli RNA associati ad altri tipi di cellule nel tessuto, da utilizzare durante le analisi a valle per correggere i cambiamenti dell’espressione genica in funzione della mutazione. 8. Incubazione di anticorpi Per ogni 1 mL di lisato eliminato, aggiungere 5 g di anticorpo anti-HA anti-HA. Per evitare la perdita del campione, sigillare il tappo del tubo con pellicola da laboratorio. Rotazione dei campioni di 16/18 h a 4 gradi centigradi.NOTA: Il tempo di incubazione degli anticorpi e la concentrazione non sono stati ottimizzati. Gli autori hanno trovato sufficiente un’incubazione notturna con 5 g; tuttavia, è possibile che un’incubazione più breve o meno anticorpo sarà adeguata, o che un’incubazione più lunga o più anticorpi miglioreranno il legame. 9. Incubazione di perline Per ogni 1 mL di lisato eliminato, aggiungere 300 lofam di proteine G perline. Ricucire il tappo del tubo con pellicola da laboratorio e ruotare per 2 h a 4 gradi centigradi. 10. Lavaggio delle perline Posizionare il tubo campione sul rack del magnete per consentire alle perline di separarsi dal lisato IPed. Pipetta fuori flusso-attraverso lysate e scartare, mantenendo le perline. Applicare 800 luna di HSWB a perline e lasciare ruotare per 10 min a 4 gradi centigradi. Posizionare il tubo campione sul rack del magnete e lasciare che le perline si separino dal lavaggio. Rimuovere e scartare il lavaggio. Applicare altri 800 l di HSWB alle perline. Chiudere il campione e lasciare ruotare per 5 min a 4 gradi centigradi. Posizionare il tubo campione sul rack del magnete e lasciare che le perline si separino dal lavaggio. Rimuovere e scartare il lavaggio. Ripetere di nuovo il passaggio 10.3. 11. Estrazione dell’RNA Posizionare il tubo campione sul rack del magnete e lasciare che le perline si separino dal lavaggio. Pipetta off e scartare lavare, mantenendo perline per l’estrazione dell’RNA. Aggiungere 3,5 lofili di 14,2 M beta-mercaptoetanolo (bME) a perline e mescolare vortice per 15 s. Estrarre l’RNA utilizzando un kit commerciale di purificazione dell’RNA, come istruzioni del produttore. Elute campione in 30 Litri di RNase libero H2O.NOTA: anche se il trattamento DNase da 10 l/mè è facoltativo per la maggior parte dei kit, è fortemente incoraggiato. Questa fase di pulizia opzionale riduce significativamente lo sfondo, consentendo una concentrazione finale più accurata. È fortemente consigliato l’uso di un kit che contiene beta-mercaptoetanolo (bME) nel buffer di lisi. bME agisce come un inibitore RNase aggiuntivo per prevenire la degradazione del campione durante l’isolamento dell’RNA. Conservare il campione a -80 gradi centigradi o analizzare immediatamente. 12. Quantificazione e analisi dei campioni Utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis, quantificare la concentrazione di RNA e la qualità preliminare. Analizzare la qualità dell’RNA estratto da campioni tramite un bioanalizzatore.NOTA: l’RNA risultante può quindi essere utilizzato per il sequenziamento dell’RNA o altre analisi a valle come il blotting a nord o la trascrizione inversa quantitativa PCR (qRT-PCR).

Representative Results

Rapporti precedenti hanno suggerito un’immunoprecipitazioni non specifica da cellule prive di Cre14. Al fine di determinare se questo è stato il caso nel nostro protocollo modificato, l’efficienza IP è stata determinata in campioni derivati da animali che trasportano sia Cre che Rpl22-HA e animali che trasportano solo uno ma non l’altro con l’aspettativa che senza un Cre-drivere Rpl22-HA, RNA immunoprecipitato dovrebbe essere minimo. Come mostrato nella Figura 3, pochissimo RNA è isolato da campioni privi di Cre o Rpl22-HA che dimostrano l’efficacia di questo protocollo per ridurre lo sfondo IP e isolare veri RNA ribosome con etichetta HA. Inoltre, sia i campioni solo Cre- che Rpl22-HArappresentano controlli negativi adatti. Dato il potenziale di fonte di reagente per influenzare in modo significativo l’efficienza della PI, una serie di anticorpi e protocolli di isolamento dell’RNA sono stati testati (Figura 4) nei campioni positivi di Cre e Rpl22-HA. Questi risultati dimostrano che la selezione del reagente può avere un impatto significativo sull’efficienza IP, pertanto qualsiasi modifica alla selezione del reagente deve essere eseguita con attenzione. Al fine di testare questo protocollo nel contesto di un mutante di proteina legante all’RNA, sono stati esaminati i testidi di wildtype-Cre-Rpl22-HA, e il gene di interesse(Figura 5). Quando la concentrazione di RNA di input e IP wildtype è stata confrontata con Gene of interest-/- input e IP, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i genotipi. Per entrambi i genotipi, tuttavia, la concentrazione di input è stata significativamente superiore alla concentrazione di IP, indicando che nel campione di input c’era più RNA (Figura 5B). Questo risultato è previsto, in quanto non tutti gli mRNA presenti nella cellula sono associati al ribosoma in un dato momento, soprattutto nel caso di cellule germinali in cui gli RNA possono essere trascritti molto prima di essere tradotti. Per confermare la qualità dei campioni di RNA inviati per il sequenziamento, i campioni sono stati eseguiti su un bioanalizzatore. I numeri di integrità dell’RNA (RIN), normalmente calcolati come il rapporto dei picchi di rRNA 28S e 18S, sono stati confrontati tra i campioni. Nei pool totali di RNA, i valori di RIN dovrebbero essere vicini a 10 con un RIN più elevato correlato a una maggiore integrità e qualità del campione dedotte. Mentre i campioni IP avevano RIN inferiore rispetto agli ingressi, i RIN erano ancora all’interno di un intervallo accettabile e non dipendevano dal genotipo del campione (Figura 5C). I valori di RIN ridotti per i campioni IPed sono probabilmente il risultato della degradazione dell’RNA anche se molto minore data la diminuzione relativamente piccola della lunghezza media dei nucleotidi degli RNA analizzati. Data la lunghezza del protocollo e le temperature necessarie per l’immunoprecipitazioni, è prevista una certa degradazione. È anche possibile che la lunghezza ridotta di RIN e RNA sia una funzione di arricchimento per specie non rRNA, come gli mRNA. Figura 1: Il metodo RiboTag. La premessa del metodo è biologicamente semplice. Un nuovo Exon 4 viene inserito nella sequenza per il locus Rpl22 a valle dell’originale Exon 4. In presenza di un driver Cre, i siti loxP su entrambi i lati dell’originale Exon 4 vengono tagliati, eccitando l’esone svasato. L’Ha-tagged Exon 4 è ora incorporato nel mRNA Rpl22, generando un RPL22 con tag HA nelle cellule che esprimono CRE. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Schema di allevamento di campioni per i topi RiboTag. Viene mostrato lo schema di allevamento utilizzato per generare animali sperimentali. È stato utilizzato uno schema su due punte. Nella generazione 1 sono stati stabiliti due gruppi paralleli di trio di allevatori. Una parte combinava l’allele di interesse (portato di primo tempo come questa specifica mutazione si traduce nella sterilità maschile) con l’emizigotoCre e dall’altro combinando l’allele di interesse, di nuovo portato di primo tempo, con Rpl22-HA. Poi, nella generazione 2, i maschi del primo abbinamento che portano l’allele di interesse e il Cre sono attraversati alla prole femminile del secondo abbinamento che portano l’allele di interesse e Rpl22-HA. Vengono determinati i genotipi della prole risultante e vengono selezionati animali di competenza sperimentale (in questo caso sia wildtype che o omozygous mutante che trasportano sia gli alleli Cre che Rpl22-HA). È importante notare per le cellule germinali che esprimono i driver Cre,gli alleli Cre e Rpl22-HA non devono essere riprodotti insieme fino alla generazione sperimentale. L’esposizione dell’allele Rpl22-HA al Cre espresso dalle cellule germinali nelle generazioni riproduttive guiderà l’escissione Rpl22-HA a cellule germinali. Qualsiasi prole risultante esprimerà globalmente Rpl22-HA impedendo così l’isolamento del ribosoma specifico per le cellule. Nel sistema descritto nel presente documento, un valore n 4 per genotipo forniva una potenza statistica sufficiente per le analisi a valle. Il numero di replica biologica deve essere determinato per ogni sistema sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Conferma dei controlli negativi. I campioni che sono Cre e Rpl22-HA mostrano un’anidura dell’RNA più elevata rispetto ai campioni che sono solo Cre o Rpl22-HA. Non c’è differenza significativa tra l’efficacia di pulldown dell’RNA del campione di Cre e Rpl22-HA, indicando che i campioni privi di Cre o Rpl22-HA sono controlli negativi adatti. Un “” indica che l’allele o il transgene corrispondente era presente in questi campioni e un “-” denota la sua assenza. IP/input rappresenta il rapporto tra RNA immunoprecipitato (IP) e RNA totale (input). Valore calcolato dalla concentrazione in nanogrammi. : indica p < 0025. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: I reagenti influiscono sul successo del protocollo. (A) Il tessuto congelato Flash produce un’efficienza di immunoprecipitazioni simile a quella del tessuto fresco. (B) È stata determinata l’efficienza IP per due anticorpi commerciali, designati come Anticorpo 1 e Anticorpo 2 (Tabella dei materiali). Quando era testato, Anticorpo 1 era più efficiente nell’abbattere l’RNA rispetto all’Anticorpo 2 che sembrava non essere in grado di distinguere tra negativo (non esprimendo né Cre o Rpl22-HA) e controlli positivi (esprimendo sia Cre che Rpl22-HA). Punti indicativi del rapporto tra IPed e RNA di input per singole repliche biologiche. (C) Quando sono stati confrontati i kit di estrazione dell’RNA (Tabella dei materiali), il Kit 2 ha sovraperformato significativamente il Kit 1. Anche se entrambi i kit hanno generato una quantità simile di RNA da controlli negativi, il Kit 2 ha prodotto un rendimento dell’RNA significativamente più elevato da campioni positivi. : indica p < 0,05, p < 0,025, p < 0,01. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Applicazione del metodo a un modello mutante. (A) Esempio di conferma del genotipo del gene di interesse tramite gonfiore occidentale utilizzando un anticorpo interno personalizzato contro il gene della proteina di interesse dimostra gene di interesse-/- (M/M) i maschi non riescono a produrre la proteina associata. GAPDH mostrato come controllo di carico. (B) Output bioanalizzatore grafico da input accoppiato e campioni IPed per campioni di wildtype e mutanti. (C) Confrontare i numeri di integrità dell’RNA (RIN) per tipo di campione e genotipo. (D) Lunghezza media dei nucleotidi delle specie di RNA analizzate per bioanalisi per tipo di campione e genotipo. : indica p < 0,05, p < 0,025, < 0,01, N.S. non significativo. N – 4 per genotipo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Esempio di conferma del driver Cre. Quantificazione di un gene tradotto all’inizio dello sviluppo delle cellule germinali (Stra8) e due geni tradotti in ritardo nello sviluppo delle cellule germinali (Tnp1 e Prm1) analizzati da qRT-PCR di RNA immunoprecipitati da RPL22-HA guidati da due diverse cellule germinali Cres, Stra8-iCre (espresso all’inizio nello sviluppo delle cellule germinali) e Hspa2-Cre (successivamente espresso nello sviluppo delle cellule germinali, in particolare dopo la traduzione di Stra8). Qui, HA-IP di Stra8 si ottiene con il driver Cre a cellule germinali, ma non con il successivo driver Cre a cellule germinali che dimostra la specificità cellulare dell’immunoprecipitazioni. Al contrario, HA-IP di trascrizioni tradotte in cellule germinali tardive è raggiunto sia da Stra8-iCre e Hspa2-Cre. Questo è previsto in quanto le cellule che esprimono Stra8-iCre genereranno RPL22 con etichetta HA per tutta la durata del loro sviluppo, mentre quelle che esprimono Hspa2-Cre lo faranno solo durante le parti successive del loro sviluppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Comprendere il translatome di un particolare tipo di cellula è inestimabile per comprendere con maggiore precisione la fisiologia di una cellula nello stato normale o mutante. Un beneficio speciale si osserva nei sistemi in cui la traduzione è disaccoppiata dalla trascrizione, come nel tessuto neurale dove la traduzione avviene molto lontana dalla trascrizione, o nelle cellule germinali in cui la trascrizione si verifica molto prima della traduzione. Rispetto ad altri metodi di analisi translatome, il più grande vantaggio del sistema RiboTag deriva dall’uso del sistema ricombinase Cre. Ciò consente la libertà di indirizzare qualsiasi popolazione cellulare che ha un driver Cre rilevante. In secondo luogo, l’IP RiboTag come descritto qui è efficace e molto meno tecnicamente impegnativo e dispendioso in termini di tempo rispetto alla profilazione polisomaosa o ribosoma. Infine, RiboTag IP può essere facilmente eseguito sul banco.

In questo protocollo sono presenti diversi passaggi critici. Il principale è la creazione della linea di topi RiboTag e la generazione di animali sperimentali per lo studio. Come per tutti i modelli genetici, deve essere applicato un attento monitoraggio degli individui all’interno della colonia di topi e un attento protocollo di genotipizzazione. La genomizzazione PCR secondo Sanz et al. dovrebbe includere primer che prendono di mira il sito loxP 5′ del wildtype exon 4 per distinguere tra alleli wildtype (260 bp) e mutant (290 bp)13. Nel caso dell’analisi RiboTag nei modelli di cellule germinali, devono essere aderitati requisiti di riproduzione molto specifici. In primo luogo, nel caso di mutanti che provocano infertilità, le strategie di allevamento ponderate dovrebbero includere metodi per ottimizzare il numero di prole con il genotipo desiderato nelle generazioni intermedie e sperimentali. In secondo luogo, nel caso di cresspecifico cellule germinali , dovrebbe essere presa cura per quanto riguarda Cre-zygosity data la sensibilità delle cellule germinali alla tossicità Del Cre. Nella cellula germinale, alti livelli di proteina Cre possono avere effetti deleteri22, vietando l’uso di animali Cre/Cre nello schema di allevamento. Infine, quando si utilizza la cellula germinale Cres, è importante isolare l’allele RiboTag dal Cre fino alla generazione finale come espressione Cre nella cellula germinale di una generazione intermedia si tradurrà in prole esprimere Rpl22-HA a livello globale.

Indipendentemente dal sistema cellulare, è possibile verificare l’affidabilità dell’espressione Cre e della specificità. L’espressione corretta del Cre e l’escissione prevista di Rpl22-HA possono essere determinate utilizzando più metodi. Nel primo, il tessuto isolato dagli animali sperimentali può essere macchiato per l’HA utilizzando l’immunosofochimica o l’immunofluorescenza15. Questo metodo è ottimale in quanto non richiede alcuna conoscenza a priori dei mRNA tradotti nei tipi di cella di destinazione. Il secondo metodo, un esempio di cui è illustrato nella Figura 6, richiede una certa conoscenza dei messaggi regolati tra le traduzioni nei tipi di cella di destinazione. In questo metodo, l’arricchimento per un mRNA regolato tra slinano conosciuto può essere confermato dal Cre-driverselezionato utilizzando la PCR quantitativa di IPed rispetto all’RNA di input. Allo stesso modo, la robusta espressione Rpl22-HA può essere confermata confrontando i campioni crezi/rpl22 (controlli positivi) con campioni Cre-/Rpl22, o Cre/Rpl22- che fungono da controlli negativi efficaci (vedere la Figura 3). Questi confronti possono essere effettuati sull’RNA IPed totale o con l’arricchimento di un mRNA regolato traslazionale noto, valutato da qRT-PCR o da qualche altro metodo quantitativo.

Problemi comuni nell’esecuzione del protocollo tendono a diventare evidenti solo quando la resa dell’RNA è inaspettatamente bassa o alta. La causa più comune di questi fallimenti deriva da una genotipizzazione non corretta degli individui. Si consiglia di conservare tessuto aggiuntivo dal campione raccolto per confermare i genotipi di tutti i campioni in caso di rese impreviste di RNA. Una volta confermate, devono essere prese in considerazione altre possibilità, tra cui la possibilità di contaminazione da RNase o di degradazione del campione. Un’attenta conservazione e movimentazione dei campioni e la manutenzione delle zone libere di RNase all’interno del laboratorio possono ridurre o eliminare notevolmente questi problemi. Anche se i problemi di isolamento dell’RNA sono un altro potenziale problema in questo protocollo, l’uso di kit commerciali riduce notevolmente questo problema, anche se la cura dovrebbe essere presa per garantire che siano mantenuti come RNase libero e non contengono soluzioni scadute. Infine, come con tutte le procedure basate su anticorpi, variazioni nel lotto, condizioni di stoccaggio, concentrazione, o anche la spedizione hanno il potenziale di influenzare negativamente la qualità dell’anticorpo e il conseguente successo del pulldown. Di conseguenza, dopo test accurati e ripetuti, abbiamo scelto l’anticorpo più coerente ed efficiente disponibile.

Questo protocollo contiene due modifiche importanti rispetto ad altri protocolli RiboTag pubblicati che aumentano significativamente la probabilità di successo. Uno è la capacità di utilizzare il tessuto congelato flash, mitigando così eventuali problemi che coinvolgono variazioni di lotto, tecnico o di esecuzione tecnica. I campioni possono essere raccolti e conservati permettendo l’isolamento di HA-ribosomi da tutti i campioni in una sola volta, abbassando quelle che possono essere le principali fonti di variazione. In secondo luogo, l’aggiunta del passaggio preclear riduce sostanzialmente il tipo di sfondo riportato da altri utenti del sistema RiboTag. Recentemente, un rapporto di protocollo di Sanz et al. indica la presenza di sfondo elevato a causa dell’abbondanza di trascrizioni associate al ribosoma da cellule non basate sucreme14. Il nostro protocollo rimedia a questo problema includendo una fase preclearing, eliminando efficacemente la presenza di RNA nei campioni IP negativi di Cre.

Come tutti i sistemi, le limitazioni intrinseche del sistema RiboTag dovrebbero essere tenute a mente. Quando si utilizzano driver Cre non caratterizzati, l’analisi dell’espressione deve essere eseguita prima della produzione sperimentale del campione. Dal punto di vista della traduzione, si dovrebbero notare diverse sfumature di questo metodo. In primo luogo, RiboTag non consente la differenziazione tra mRNA in grado di tradurre e quelli attivamente tradotti. Di conseguenza, gli attuali metodi basati su RiboTag non consentono la quantificazione dell’efficienza della traduzione in funzione dei singoli mRNA. Se l’efficienza della traduzione è di interesse, può essere misurata su una base cellulare specifica se il metodo RiboTag è combinato con altri strumenti di analisi translatomi come la profilazione polisoma. In secondo luogo, è fondamentale prendere in considerazione i cambiamenti totali dell’abbondanza di RNA derivanti dalla varianza individuale o dipendente dal genotipo. È per questo motivo che un attento isolamento dell’RNA di input accompagna l’immunoprecipitazioni e i campioni derivati da ciascuno di essi rimangono accoppiati in tutte le analisi a valle. Infine, e per quanto riguarda l’analisi basata su RiboTag, va ricordato che l’associazione con un ribosoma non prova necessariamente la traduzione sta avvenendo. I metodi secondari di analisi dovrebbero essere eseguiti per confermare la regolazione traslazionale negli obiettivi di interesse.

Questo protocollo descrive l’isolamento degli RNA associati al ribosoma dalle cellule germinali dei topi maschi utilizzando il modello RiboTag. Non tenendo conto dell’allevamento dei topi e della raccolta dei campioni, il protocollo dura due giorni, con tre ore il primo giorno, meglio fatto nel pomeriggio, un’incubazione notturna, seguita da cinque ore di lavoro la mattina successiva. Si raccomanda vivamente che la preparazione di soluzioni di stock (HB e HSWB) così come la macinazione dei tessuti sia effettuata in anticipo. Il successo complessivo del protocollo dipende dalla corretta genotipizzazione e da condizioni rigorose e prive di RNasi. La capacità di esaminare il translatome di specifici tipi di cellule permetterà a studi futuri di comprendere meglio la relazione tra la trascrizione, la traduzione e il proteoma in una miriade di tipi di cellule e provenienze mutanti.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NIH NICHD R00HD083521 allo SME e dal supporto interno della Rutgers University allo SME.

Materials

1 mL mechanical pipette Preference of researcher
1,4-Dithio-DL-threitol (8% Alfa Aesar A15797
1.7 mL or 2mL tubes Preference of researcher
10 mL conical tubes Preference of researcher
10 mL serological pippettes Preference of researcher
10 uL mechanical pipette Preference of researcher
20 uL mechanical pipette Preference of researcher
200 uL mechanical pipette Preference of researcher
5 mL serological pipettes Preference of researcher
50 mL conical tubes Preference of researcher
Anti-HA tag antibody Abcam ab18181 Antibody 1
Anti-HA tag antibody Antibodies.com A85278 Antibody 2
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice The Jackson Laboratory 17490 Or mice carrying Cre driver of choice
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice The Jackson Laboratory 11029
Benchtop centrifuge Preference of researcher
C1000 Touch thermal cycler BioRad 184-1100 Or equivalent thermal cycler
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000537 Or equivalent refrigerated centrifuge
Cyclohexamide Sigma Aldrich C7698-1g
Dissection scissors Preference of researcher
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen by ThermoFisher Scientific 10009D
DynaMag-2 Magnet rack Invitrogen by ThermoFisher Scientific 12321D
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 OMEGA 6834-01 Kit 1
Heat block Preference of researcher
Heparin Sigma Aldrich 84020
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272-500g
Microdissection forceps Preference of researcher
Microdissection scissors Preference of researcher
MiRNeasy kit Qiagen 217004 Kit 2
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Or equivalent spectrophotometer
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem Millipore Sigma 492016
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free ThermoFisher Scientific A32965
Potassium (KCl) Sigma Aldrich P3911-2.5kg
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs Inc. M0314
SI vortex-genie 2 Scientific Industries SI-0236 Or equivalent benchtop vortex
Tips for 1 mL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 10 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 20 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 200 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-500
Tube Revolver / Rotator ThermoFisher Scientific 88881001 Or equivalent rotator
VWR Powerpette Plus pipet controller VWR 75856-450 Or equivalent pipette controller
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References

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RiboTagImmunoprecipitationGerm CellsMale MouseRNA ExtractionHomogenization BufferHigh-salt Wash BufferLysis Buffer

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Chukrallah, L. G., Seltzer, K., Snyder, E. M. RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse. J. Vis. Exp. (157), e60927, doi:10.3791/60927 (2020).
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