Micropatterning a cella singola semplice senza litografia con stencil laser-cut

L’avvento degli hiPSC e il successivo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione diretta in diversi tipi di cellule hanno permesso di studiare lo sviluppo e la malattia a livello molecolare e specifico del paziente, in particolare utilizzando cardiomiociti iPSC derivati dal paziente (iPSC-CMs) per modellare cardiomiopatie^1,2. Tuttavia, una delle principali limitazioni allo studio dello sviluppo e della fisiologia utilizzando il sistema iPSC e altri modelli in vitro è l’assenza di un microambiente strutturato. In situ, le cellule sono soggette ai vincoli della matrice extracellulare (ECM), così come le cellule vicine. La particolare composizione biochimica e la rigidità di questi microambienti dettano la distribuzione spaziale delle cellule e i fattori disponibili per l’adesione cellulare. Questo, a sua volta, influenza le vie di segnalazione intracellulare, l’espressione genica e la determinazione del destino cellulare. Ad esempio, iPSC-CM micromodellato in una forma di asta simile a un adulto ha una capacità contrattile significativamente migliore, flusso di calcio, organizzazione mitocondriale, elettrofisiologia e formazione trasversa-tubulo³. Pertanto, le proprietà del microambiente sono parte integrante della regolazione delle funzioni cellulari.

Le precedenti tecniche di micromodellazione si basavano fortemente sulla fotolitografia (Figura 1A). In questa tecnica, uno strato di polimero fotosensibile, o fotoresist, viene filato su un substrato piatto dalla soluzione per formare una pellicola sottile di circa 1 m di spessore. Successivamente, la luce ultravioletta (UV) viene applicata al fotoresist attraverso una maschera contenente il modello desiderato. L’esposizione alla luce ultravioletta (UV) altera chimicamente il fotoresist modificandone la solubilità nella rispettiva soluzione per sviluppatori, trasferendo il modello desiderato dalla maschera al substrato. Molti metodi di micropatterning incorporano la fotolitografia, in quanto conferisce il nanometro al controllo a livello di micrometro sulla progettazione dei modelli cellulari. Tuttavia, la rotazione del fotoresist è altamente sensibile alle impurità, perché le particelle di polvere più piccole interromperanno la diffusione della soluzione in una pellicola sottile. La fotolitografia deve pertanto essere effettuata in strutture non contaminate, che sono costose da mantenere e richiedono particolari competenze da utilizzare. Inoltre, le sostanze chimiche utilizzate nella fotolitografia sono spesso tossiche per le cellule e possono denaturare importanti biomolecole. Pertanto, la fotolitografia pone notevoli ostacoli alla fabbricazione di micromodelli per pratiche applicazioni biologiche.

Nel 1994, Whitesides e colleghi⁴ hanno superato alcune delle sfide associate alla fotolitografia aprendo la strada a una raccolta di tecniche chiamate litografia morbida. Nella litografia morbida, una superficie microstrutturata realizzata con polidimetilsiloxane (PDMS), un materiale trasparente, simile alla gomma, viene utilizzata per generare un modello di proteine ECM⁴. Le tecniche litografiche morbide comuni includono la stampa a microcontatto e la modellazione microfluidica. Nella stampa a microcontatto, attualmente il metodo litografico morbido più diffuso, un timbro PDMS rivestito con proteine ECM trasferisce il materiale su una superficie alle aree contattate dal francobollo (Figura 1B). Nel patterning microfluidico, le microstrutture sono progettate su una superficie PDMS in modo che quando il timbro viene premuto su un substrato, viene creata una rete di microcanali, attraverso i quali i fluidi possono essere consegnati alle aree desiderate (Figura 1C)⁵. La litografia soft offre diversi vantaggi rispetto alla fotolitografia. Una volta che un wafer master è microfabbricato, i francobolli PDMS possono essere facilmente replicati senza ulteriore impiego di strutture per camere pulite. Inoltre, l’assenza di solventi organici nel processo di litografia morbida consente l’utilizzo di materiali polimerici come il polistirolo, tipicamente utilizzato nella coltura cellulare. Infine, la micropatterning con metodi litografici morbidi non è limitata alle superfici piatte. Così, la litografia morbida aumenta l’accessibilità e la funzionalità della fabbricazione di micropattern rispetto alla fotolitografia⁶. Tuttavia, la litografia morbida presenta svantaggi significativi. Ad esempio, una fase iniziale di incisione, utilizzando la fotolitografia, è ancora necessaria per microfabbricare il timbro. Inoltre, la micromodellazione con un timbro PDMS è soggetta a variazioni nella qualità del trasferimento di proteine sul substrato⁶. Evitare queste discrepanze richiede ottimizzazione e consistenza nella pressione applicata al timbro PDMS durante il trasferimento di proteine, altrimenti la deformazione e la distorsione delle dimensioni delle feature degli stampi PDMS possono verificarsi⁶. C’è anche una grande preoccupazione di utilizzare ripetutamente il PDMS a causa dell’assorbimento di piccole molecole⁷.

Per evitare l’uso di fotolitografia morbida e timbri PDMS, descriviamo un metodo di micropatterning a singola cellula basato su stencil e litografia che supera molti degli ostacoli associati alla fotolitografia e alla litografia morbida. In questo metodo, un idrogel di poliacrilammide viene utilizzato come substrato per l’incorporazione di proteine ECM a base di stencil, consentendo la placcatura selettiva di singoli hiPSC-CM. Questa tecnica è altamente compatibile con i materiali polimerici utilizzati nelle classiche condizioni di coltura cellulare. Inoltre, con una corretta pulizia e manutenzione, gli stencil sono riutilizzabili e resistenti alla degradazione e all’assorbimento delle proteine durante il processo di microfabbricazione. Infine, il processo di modellazione è tecnicamente robusto, economico, personalizzabile e accessibile a coloro che non hanno competenze di bioingegneria specializzate. Questa tecnica di micropatterning basato su stencil è stata ampiamente utilizzata nelle nostre recenti pubblicazioni modellando varie cardiomiopatie^8,9,10.