המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח
Summary
מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.
Abstract
חיסוני משמש נרחב במחקר ביו להראות דפוס הביטוי הסלולרי של חלבון נתון. חיסוני מולטיפלקס מאפשר תיוג באמצעות נוגדנים ראשוניים מרובים. כדי למזער את הנוגדן החוצה פעילות, חיסוני המגה באמצעות מכתים עקיף דורש נוגדנים ראשוניים ללא תווית ממינים מארחים שונים. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים למינים שונים אינו תמיד זמין. כאן, אנו מתארים שיטה של שימוש בנוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים מאותם מינים מארחים (למשל, במקרה זה שני נוגדנים הם מן הארנב) עבור מגנטים למגה-ונציה על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) עכבר סעיפים האדרנל. שיטה זו משתמשת באותו ההליך וריאגנטים המשמשים בשלב אחזור אנטיגן כדי להסיר את הפעילות של קומפלקס הנוגדן העיקרי שהיה מוכתם בעבר. השקופיות היו מוכתמות הנוגדן הראשוני הראשון באמצעות פרוטוקול חיסוני כללי ואחריו צעד מחייב עם נוגדן משני biotinylated. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת פיתוח האותות avidin-biotin-peroxidase באמצעות פלואורואופפור-טירומידה כמצע. הפעילות החיסונית של מתחם הנוגדן הראשוני הראשון הוסרו באמצעות טבילה בתמיסה הרתיחה של נתרן ציטראט במשך 8 דקות. התצהיר המולא-מסיסים, שנותר על המדגם, שאיפשר לשקופית להיות מוכתם בנוגדנים ראשוניים אחרים. למרות שיטה זו מבטלת את רוב האותות החיוביים השווא, חלק מהרקע של הנוגדן חוצה פעילות מחודשת עשוי להישאר. אם הדגימות מועשר בביוטין, נוגדן משני peroxidase מעלה עשוי לשמש כדי להחליף את הנוגדן המשני biotinylated כדי למנוע את חיובי שווא מן התאושש ביולוגי אנדוסוגני.
Introduction
בתוך החומרים החיסונית, מכתים ישירות באמצעות נוגדנים ראשוניים מצוים יכול לספק תוצאות אינפורמטיביות. מבלי להשתמש בנוגדנים משניים, שיטת הצביעה הישירה מהווה סיכון נמוך לאותות לוקליזציה מזוייפים מנוגדן לפעילות מחודשת. עם זאת, הכתבים הצוחיים (fluorophore אנזימים) או ביוטין על הנוגדן הראשוני מגביל את השימוש העתידי שלה. לחילופין, חיסוני עקיף מספק בדרך כלל אותות חזקים יותר באמצעות נוגדן ראשוני ללא מעלה עם נוגדן משני מתויג. באופן אידיאלי, נוגדנים ראשוניים בלתי מצובאים בשימוש בבית החומרים החיסוני צריך לבוא ממינים שונים של מארחים כדי להימנע מפני הנוגדנים החוצה פעילות. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים אינו תמיד זמין.
מספר שיטות הוקמו כדי לחסל את הסיכון של הנוגדן המשני המגיבים עם נוגדן ראשוני בלתי רצוי. אחת השיטות הנפוצות היא השימוש ב-F (ab) נוגדן monomeric לחסום את כל אפיסקופים הכריכה הנותרים על מתחם הנוגדן הראשוני הראשון לפני הצביעת עם הנוגדן העיקרי השני1. הנוגדן בנוכחות, אשר דומה לרצועה ומחדש של גיליון כתמים מערבי, מסיר את מתחם הנוגדן הקודם ויטראז מבלי להתפשט את התצהיר של מולקולות עיתונאי לזיהוי כגון 3, 3 ‘-diaminobenzidine (לפרק)2 ו-פלורסנט tyramide התצהיר3. בשיטה זו, מולקולות עיתונאי בצבעים שונים יכולות להציג את התוצאה של השקופית באותה שקופית. הצביעת של מולטיפלקס הינה גם השגה מוחלטת של שכבות הנוגדנים שהופקדו קודם לכן והיישור של תמונות שנרכשו לאחר מכן מנוגדנים אחרים4,5. שיטות אלו נותנות תוצאות אמינות, אם כי לכל שיטה יש מגבלות והיא דורשת הליכים מסובכים או מערכת דימות מיוחדת.
הפרוטוקול הנוכחי מציג את היישום של נוגדן שיטת החשפנות עם שימוש של מאגרים זמינים בדרך כלל. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של מרכיבים מגנטים לשימוש באמצעות משטחי האדרנל (FFPE) עם שני נוגדנים ראשוניים שאינם מתויגים מאותו זן מארח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתמים חיסוני מולטיפלקס שימושי כדי לבחון את ההתאמה התאית של שני אנטיגנים או יותר. טכניקה זו בשימוש נרחב נותן תוצאות משכנעות לוקליזציה כאשר נוגדנים העיקרי הם מצועם כתבים שונים (כתמים ישירים). עם זאת, מכתים ישירה בדרך כלל מספק אותות חלשים יותר לעומת כתמים עקיפים, אשר כרוך נוגדנים משניים מצופנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
