Summary

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020
doi:

Summary

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Abstract

Clamídia trachomatis é um patógeno intracelular obrigatório que tem sido historicamente difícil de manipular geneticamente. O progresso definitivo na elucidação dos mecanismos que C. trachomatis usa para criar e manter um nicho intracelular privilegiado tem sido limitado devido à falta de ferramentas genéticas. Felizmente, recentemente houve vários novos avanços nas técnicas de manipulação genética. Entre elas está o desenvolvimento da mutagênese de troca acetélica relatada por fluorescência (FRAEM). Este método permite exclusão genética direcionada juntamente com a inserção de uma resistência a antibióticos de codificação de de seleção e proteína fluorescente verde (GFP). A dependência dessa estratégia pode ser complicada quando se mira genes dentro de operões policistronicos devido ao potencial de efeitos polares em genes a jusante. A troca de acetélica de floxed (FLAEM), o protocolo para o qual está descrito aqui, foi desenvolvido para aliviar os efeitos polares induzidos por. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção após exclusão direcionada por troca de algélico. As cepas resultantes contêm exclusões genéticas sem marcadores de uma ou mais sequências de codificação. Essa técnica facilita a avaliação direta da função genética e amplia o repertório de ferramentas para manipulação genética em C. trachomatis.

Introduction

A clamídia trachomatis é a principal causa de doenças sexualmente transmissíveis bacterianas e representa um fardo significativo para a saúde humana. Mais de 100 milhões de pessoas são infectadas todos os anos com C. trachomatis1. Aproximadamente 70% das infecções em mulheres são assintomáticas apesar dos efeitos prejudiciais à saúde reprodutiva, como doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e/ou infertilidade. As sequelas da doença estão diretamente relacionadas à imunopatologia iniciada pela infecção por C. trachomatis 2. Uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida; portanto, compreender a função de fatores de virulência bacteriana e outros produtos genéticos bacterianos é uma questão de pesquisa importante e urgente.

Como bactérias intracelulares, invasão celular hospedeira, replicação intracelular, liberação de descendência e evasão de respostas imunológicas hospedeiras são processos críticos. C. trachomatis forma uma membrana parasitophorous vinculada ao vacuole, denominada inclusão, para o desenvolvimento intracelular. O estabelecimento da inclusão e muitos outros processos críticos são alcançados por secreção de proteínas effectoras por meio de um sistema de secreção tipo III (T3SS)3. Elucidar as funções desses efetivadores secretos foi limitado por muitos anos devido à intração genética de C. trachomatis. Ao contrário de E. coli,muitas técnicas clássicas de clonagem não são aplicáveis à Clamídia. Algumas grandes limitações envolvem eficiência de transformação, falta de repórteres de contrasseleção, como sacb e manutenção plasmática. Enquanto os plasmídeos E. coli geralmente podem ser mantidos indefinidamente com origem de replicação e pressão seletiva adequada, os plasmídeos C. trachomatis exigem mais oito quadros de leitura abertos (pgp1-8) para manutenção que são encontrados no plasmídeo pL2 nativo dentro do L2 serovar4.

Nos últimos anos, foram geradas múltiplas ferramentas genéticas que acomodam a biologia única da Clamídia, mas ainda há limitações5,6,7. A mutação química pelo tratamento metanosulfona (EMS) pode introduzir mutações missenses, ou (menos frequentemente) pode resultar em transições de nucleotídeos introduzindo um codon parada prematuro para produzir uma mutação sem sentido8. A inserção transposon é eficiente para a interrupção genética, mas a tecnologia atual na pesquisa da Clamídia é trabalhosa edemorada 9. Tanto o tratamento ems quanto as técnicas de mutagênese transposon geram mutações aleatórias e exigem métodos rigorosos de triagem para isolar as cepas mutantes. Um método para interromper genes por inserção de intronas do grupo II (por exemplo, TargeTron) permite a mutação gênese dirigida; no entanto, este método é limitado pela eficiência, e o local de inserção nem sempre é devidamente previsto10.

A mutagênese de troca acetélica relatada pela fluorescência (FRAEM) é uma estratégia usada para exclusão genética direcionada, juntamente com a inserção de um de seleção que proporciona resistência a antibióticos e um repórter de fluorescência11. No entanto, o FRAEM é complicado pelo potencial de efeitos polares induzidos por em genes a jusante, especialmente quando visam genes dentro de operões policistronicos. A troca de acetélica de floxed (FLAEM) é uma nova abordagem genética desenvolvida para aliviar os efeitos polares induzidos por anteriormente observados com o de seleção FRAEM12. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção e restaurar a expressão de genes a jusante. O de seleção contendo resistência a antibióticos e proteína fluorescente verde (GFP) é reprojetado com locais de loxP flancos. Esses locais loxP podem se recombinar na presença de Cre recombinase e resultar em excisão do do genoma13. Esta estratégia tem sido demonstrada para aliviar os efeitos polares induzidos ao mirar tmeA para exclusão12,14.

Tanto os métodos FRAEM quanto flaem utilizam o mesmo vetor suicida, pSUmC 4.0, que pode ser mantido condicionalmente através da expressão induutível de pgp6. A expressão do pgp6 já se mostrou necessária para a retenção plasmática e, portanto, é aproveitada para controlar a manutenção plasmática11,15. Quando C. trachomatis é cultivado na mídia complementada com tetraciclina anidra (aTc) para induzir a expressão pgp6, o vetor é mantido. Na ausência de aTc, o vetor está perdido. A exclusão genética direcionada é alcançada através da troca alelica do gene para a de seleção. As regiões de 3 kb diretamente rio acima e rio abaixo do gene alvo servem como braços de homologia para recombinação. Estes braços são clonados no vetor pSUmC 4.0 flanqueando o de seleção. Eventos bem-sucedidos de transformação e recombinação de C. trachomatis são observados através de relatórios de fluorescência. Expressão de mCherry na espinha dorsal vetorial e gfp dentro do de seleção produz inclusões fluorescentes vermelhas e verdes. Uma vez que o ATc é removido da mídia cultural, as inclusões somente verdes indicam eventos de recombinação bem-sucedidos com a perda do vetor suicida e a integração do de seleção no genoma bacteriano.

FlaEM representa uma extensão do FRAEM através da transformação subsequente de um vetor crerecombinase expresso, pSU-Cre, na recém-criada cepa mutante. A recombinação cre facilita a recombinação entre sites loxP e excisão do de seleção. Eventos de recombinação são indicados através de relatórios de fluorescência. O vetor pSU-Cre codifica mCherry; assim, a transformação bem sucedida é indicada pela adição de fluorescência vermelha ao GFP-expressando inclusões. O cultivo na ausência de pressão seletiva para o resulta em recombinação mediada por Cre nos locais do loxP, e a perda do é indicada por inclusões somente vermelhas. Assim como no pSUmC-4.0, a expressão induutível do pgp6 é usada para manter condicionalmente o pSU-Cre. Uma vez que a seleção de aTc e antibióticos são removidos, o plasmídeo é curado, e a cepa de exclusão sem marcadores resultante é não fluorescente. Este método aborda a questão dos efeitos polares induzidos por.

Protocol

1. Design e Montagem do pSUmC-4.0 com Homology Arms Específico para o Gene of Interest Identifique as regiões de ~3 kb diretamente rio acima e a jusante do gene destinado à exclusão para servir como os braços homologia de 5′ e 3′ para recombinação homologous (Figura 1). Design pcR primers to 1) amplificar o braço de homologia de 3 kb 5′ do DNA genômico cromadial e 2) conter uma saliência específica de 15-30 bp específica para pSUmC-4.0 quando digerida no site …

Representative Results

O método de exclusão de genes sem marcadores em C. trachomatis usando FLAEM depende de técnicas cuidadosas de clonagem e transformação. A recombinação acetélica bem sucedida é um primeiro passo essencial e requer a identificação e inserção de braços de homologia no vetor de clonagem pSUmC-4.0(Figura 1). Um segundo passo essencial para a exclusão genética sem marcadores é a remoção do repórter de fluorescência e de seleção de antibióticos pela edição do geno…

Discussion

O protocolo descrito aqui para a geração de exclusões genéticas sem marcadores em C. trachomatis pela FLAEM permite a exclusão direcionada de genes não essenciais e elimina efeitos polares induzidos por. O protocolo conta com um design cuidadoso de braços homologia de 5′ e 3′ inseridos no vetor suicida pSUmC 4.0, transformação eficiente de C. trachomatis e triagem cuidadosa de cepas mutantes isoladas. A engenharia de genomas bem sucedida através deste método resulta em bactérias que não sã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho contou com o apoio de bolsas do Serviço Público de Saúde do Instituto Nacional de Saúde, NIAID (subsídios A1065530 e Al124649), para campos k.a.

Materials

Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam/dcm Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

References

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Cite This Article
Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

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