Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren
Summary
Wir bieten ein Protokoll, um Gene, die extrazelluläre Matrixproteine (ECM) in C2C12-Myoblasten kodieren, mit Small-Hairpin (sh) RNA zu fallig zu senken. Als Beispiel für ADAMTSL2 beschreiben wir die Methoden zur Validierung der Knockdown-Effizienz auf mRNA-, Protein- und Zellebene während der Myotube-Differenzierung von C2C12.
Abstract
Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) sind entscheidend für die Entwicklung von Skelettmuskeln und Homöostase. Der stabile Knockdown von Genen, die für ECM-Proteine in C2C12-Myoblasten kodieren, kann angewendet werden, um die Rolle dieser Proteine bei der Entwicklung der Skelettmuskeln zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erschöpfung des ECM-Proteins ADAMTSL2 als Beispiel, indem man small-hairpin (sh) RNA in C2C12-Zellen verwendet. Nach der Transfektion von shRNA-Plasmiden wurden stabile Zellen mit Puromycin chargenausgewählt. Wir beschreiben weiter die Aufrechterhaltung dieser Zelllinien und die phänotypische Analyse mittels mRNA-Expression, Proteinexpression und C2C12-Differenzierung. Die Vorteile der Methode sind die relativ schnelle Erzeugung stabiler C2C12-Knockdown-Zellen und die zuverlässige Differenzierung von C2C12-Zellen in mehrkernige Myotuben bei Erschöpfung des Serums im Zellkulturmedium. Die Differenzierung von C2C12-Zellen kann durch Hellfeldmikroskopie und durch Messung der Expressionskonzentrationen kanonischer Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin-Schwere Kette (MyHC) überwacht werden, was auf das Fortschreiten der C2C12-Myoblastendifferenzierung in Myoröhren hinweist. Im Gegensatz zum vorübergehenden Knockdown von Genen mit small-interfering (si) RNA können Gene, die später bei der C2C12-Differenzierung oder während der Myotube-Reifung exprimiert werden, effizienter gezielter werden, indem C2C12-Zellen erzeugt werden, die shRNA stabil exprimieren. Einschränkungen der Methode sind eine Variabilität der Knockdown-Effizienz, abhängig von der spezifischen shRNA, die durch die Verwendung von Gen-Knockout-Strategien auf der Grundlage von CRISPR/Cas9 überwunden werden kann, sowie potenziellen Off-Target-Effekten der shRNA, die in Betracht gezogen werden sollten.
Introduction
Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) unterstützen strukturell alle Gewebe, vermitteln die Zell-Zell-Kommunikation und bestimmen das Zellschicksal. Die Bildung und dynamische Umgestaltung des ECM ist daher entscheidend für die Erhaltung der Gewebe- und Organhomöostase1,2. Pathologische Varianten in mehreren Genen, die für ECM-Proteine kodieren, führen zu Muskel-Skelett-Erkrankungen mit Phänotypen, die von Muskeldystrophien bis zum pseudomouscularen Aufbau3,4reichen. Zum Beispiel verursachen pathogene Varianten in ADAMTSL2 die extrem seltene Muskel-Skelett-Störung geleophysische Dysplasie, die mit pseudomuskulärem Aufbau, d.h. einer scheinbaren Zunahme der Skelettmuskelmasse5. Zusammen mit Genexpressionsdaten bei Maus und Menschen deutet dies auf eine Rolle für ADAMTSL2 bei der Entwicklung von Skelettmuskeln oder der Homöostase6,7hin.
Das Protokoll, das wir hier beschreiben, wurde entwickelt, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem ADAMTSL2 die Entwicklung von Skelettmuskeln und/oder Homöostase in einer Zellkulturumgebung moduliert. Wir schlugen ADAMTSL2 in der murinen C2C12 Myoblast-Zelllinie stabil nieder. C2C12 Myoblaste und ihre Differenzierung in Myotuben ist ein gut beschriebenes und weit verbreitetes Zellkulturmodell für Skelettmuskeldifferenzierung und Skelettmuskelbioengineering8,9. C2C12-Zellen durchlaufen nach serumerumerentzug unterschiedliche Differenzierungsschritte, was zur Bildung von mehrnukleierten Myoröhren nach 3 bis 10 Tagen in der Kultur führt. Diese Differenzierungsschritte können zuverlässig überwacht werden, indem mRNA-Spiegel verschiedener Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin schwere Kette (MyHC) gemessen werden. Ein Vorteil der Erzeugung stabiler Genknockdowns in C2C12-Zellen besteht darin, dass Gene, die in späteren Stadien der C2C12-Differenzierung exprimiert werden, effizienter ins Visier genommen werden können, verglichen mit einem vorübergehenden Knockdown, der durch klein störende (si) RNA erreicht wird, die in der Regel 5 bis 7 Tage nach der Transfektion dauert und von der Transfektionseffizienz beeinflusst wird. Ein zweiter Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist die relativ schnelle Generierung von Chargen von C2C12-Knockdown-Zellen mit Puromycin-Auswahl. Alternativen wie CRISPR/Cas9-vermittelter Genknockout oder die Isolierung von primären Skelettmuskelzellvorläufern von Mäusen mit menschlichem oder Zielgenmangel sind technisch schwieriger oder erfordern die Verfügbarkeit von Patientenmuskelbiopsien bzw. Zielgen-Mangelmäusen. Ähnlich wie bei anderen zellkulturbasierten Ansätzen gibt es jedoch Einschränkungen bei der Verwendung von C2C12-Zellen als Modell für die Differenzierung von Skelettmuskelzellen, wie die zweidimensionale (2D) Natur des Zellkultur-Setups und das Fehlen der in vivo Mikroumgebung, die entscheidend ist, um undifferenzierte Skelettmuskelvorläuferzellen10zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben hier ein Protokoll für den stabilen Abbau von ECM-Proteinen in C2C12-Myoblasten und für die phänotypische Analyse der Differenzierung von C2C12-Myoblasten in Myotuben. Mehrere Faktoren bestimmen das Ergebnis des Experiments und müssen sorgfältig geprüft werden. Die Aufrechterhaltung von C2C12-Zellen in der Vermehrungsphase ist ein entscheidender Schritt, um die C2C12-Zellen im Myoblast-Vorläuferzustand zu halten. Die Beibehaltung der Fähigkeit von C2C12-Zellen, sich konsequent in Myotuben zu diffe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. wird von den National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, Grant Number AR070748) und Der Samenförderung der Leni & Peter W. May Department of Orthopedics, Icahn School of Medicine Mt. Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
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