Summary

Estudando efeitos neurocomportamentais de poluentes ambientais em larvas de zebrafish

Published: February 05, 2020
doi:

Summary

Um protocolo experimental detalhado é apresentado neste artigo para avaliação da toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais utilizando um modelo de larvas de zebrafish, incluindo o processo de exposição e testes para indicadores neurocomportamentais.

Abstract

Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm se mostrado neurotóxicos, especialmente nos estágios iniciais de desenvolvimento dos organismos. Larvas de zebrafish são um modelo preeminente para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais. Aqui, prevê-se um protocolo experimental detalhado para a avaliação da neurotoxicidade dos poluentes ambientais utilizando larvas de zebrafish, incluindo a coleta dos embriões, o processo de exposição, indicadores neurocomportamentais, o processo de teste e análise de dados. Além disso, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o sucesso do ensaio. O protocolo tem sido usado no desenvolvimento de drogas psicopáticas, pesquisas sobre poluentes neurotóxicos ambientais, e pode ser otimizado para fazer estudos correspondentes ou ser útil para estudos mecanicistas. O protocolo demonstra um processo de operação claro para estudar efeitos neurocomportamentais em larvas de zebrafish e pode revelar os efeitos de várias substâncias neurotóxicas ou poluentes.

Introduction

Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm sido comprovados neurotóxicos1,2,3,4. No entanto, a avaliação da neurotoxicidade in vivo após a exposição a poluentes ambientais não é tão fácil quanto a da perturbação endócrina ou toxicidade do desenvolvimento. Além disso, a exposição precoce a poluentes, especialmente em doses ambientalmente relevantes, tem atraído cada vez mais atenção nos estudos de toxicidade5,6,7,8.

O zebrafish está sendo estabelecido como um modelo animal adequado para estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento precoce após a exposição a poluentes ambientais. Zebrafish são vertebrados que se desenvolvem mais rápido do que outras espécies após a fertilização. As larvas não precisam ser alimentadas porque os nutrientes na corção são suficientes para sustentá-las por 7 dias após a fertilização (dpf)9. Larvas saem da corção de ~2 dpf e desenvolvem comportamentos como natação e giro que podem ser observados, rastreados, quantificados e analisados automaticamente utilizando instrumentos de comportamento10,11,12,13 a partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. Além disso, testes de alto nível também podem ser realizados por instrumentos de comportamento. Assim, as larvas de zebrafish são um modelo notável para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais19. Aqui, um protocolo é oferecido usando monitoramento de alta base para estudar a toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais em larvas de zebrafish estímulos leves.

Nosso laboratório estudou a toxicidade neurocomportamental de 2,2′,4,4′-tetrabromodifenídel eter (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4′-tetra Eter diphenyl deca(BDE-209), chumbo e paraffins clorados comerciais23 usando o protocolo apresentado. Muitos laboratórios também usam o protocolo para estudar os efeitos neurocomportamentais de outros poluentes em larvas ou peixes adultos24,25,26,27. Este protocolo neurocomportamental foi usado para ajudar a fornecer suporte mecanicista mostrando que a exposição de baixa dose ao bisfenol A e a substituição do bisfenol S induziu neurogênese hipotámica prematura em zebrafish embrionário27. Além disso, alguns pesquisadores otimizaram o protocolo para realizar estudos correspondentes. Um estudo recente eliminou a toxicidade do beta amiloide (Aβ) em um modelo de zebrafish fácil e de alto nível usando nanopartículas de ouro revestidas de casein (βCas AuNPs). Mostrou que βCas AuNPs em circulação sistêmica translocou através da barreira hematoencefálica de larvas de zebrafish e seqüendo a β42 intracerebral, provocando toxicidade de uma maneira inespecífica, semelhante a acompanhante, que foi apoiada pela patologia comportamental28.

Locomoção, ângulo de caminho e atividade social são três indicadores neurocomportamentais utilizados para estudar os efeitos da neurotoxicidade das larvas de zebrafish após a exposição a poluentes no protocolo apresentado. A locomoção é medida pela distância de natação das larvas e pode ser danificada após a exposição a poluentes. O ângulo do caminho e a atividade social estão mais intimamente relacionados com a função do cérebro e do sistema nervoso central29. O ângulo do caminho refere-se ao ângulo do caminho do movimento animal em relação à direção de natação30. Oito classes angulares de ~-180°-~+180° estão definidas no sistema. Para simplificar a comparação, seis classes no resultado final são definidas como curvas de rotina (-10° ~0°, 0° ~+10°), curvas médias (-10° ~-90°, +10° ~+90°), e curvas responsivas (-180° ~-90°, +90° ~+180°) de acordo com nossos estudos anteriores21,22. A atividade social de dois peixes é fundamental para o comportamento de esnomas em grupo; aqui uma distância de < 0,5 cm entre duas larvas válidas é definida como contato social.

O protocolo aqui apresentado demonstra um processo claro para estudar efeitos neurocomportamentais nas larvas de zebrafish e fornece uma maneira de revelar os efeitos da neurotoxicidade de várias substâncias ou poluentes. O protocolo beneficiará pesquisadores interessados em estudar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais.

Protocol

O protocolo está de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Tongji. 1. Coleção de embriões de zebrafish Coloque dois pares de zebrafish Tubingen adulto saudável na caixa de desova na noite anterior à exposição, mantendo a relação sexual em 1:1. Remova o peixe adulto de volta ao sistema 30-60 min após o amanhecer na manhã seguinte. Remova os embriões para fora da caixa de desova. Enxágüe os embri?…

Representative Results

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar os efeitos neurocomportamentais de poluentes ambientais usando larvas de zebrafish estímulos leves. A locomoção, o ângulo de caminho e os testes de atividade social são definidos na introdução. A configuração das microplacas nos testes de locomoção e ângulo de caminho e as imagens do software são mostradas abaixo. Além disso, nossos próprios resultados de pesquisa são apresentados como exemplos. Dois estudos apresentam os efeitos…

Discussion

Este trabalho fornece um protocolo experimental detalhado para avaliar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais usando larvas de zebrafish. Os zebrafish passam pelo processo de embriões a larvas durante o período de exposição, o que significa que o bom cuidado dos embriões e larvas é essencial. Qualquer coisa que afete o desenvolvimento dos embriões e larvas pode influenciar o resultado final. Aqui, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o suce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores são gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (21876135 e 21876136), pelo Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia da China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), fundação do MOE-Xangai Laboratório-Chave de Saúde Ambiental da Criança (CEH201807-5) e Conselho sueco de Pesquisa (nº 639-2013-6913).

Materials

48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

View Video