Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Yüksek Verimli Üretimi için Dondurulmuş Çözülmüş Embriyoların Kullanımı
Summary
Burada, tek hücreli embriyoların kriyopreservation için değiştirilmiş bir yöntem yanı sıra genetik olarak değiştirilmiş farelerin verimli nesil için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanarak çiftler bir protokol sıyoruz.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş (GM) farelerin kullanımı gen fonksiyonunu anlamak ve insan hastalıklarının altında yatan mekanizmaları çözmek için çok önemli hale gelmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların genomu eşi görülmemiş verimlilik, sadakat ve basitlikle değiştirmelerine olanak tanır. Bu teknolojiden yararlanarak, araştırmacılar GM fareler üretmek için hızlı, verimli ve kolay bir protokol arıyorlar. Burada, dondurulan çözülmüş embriyoların daha yüksek gelişimsel oranına yol açan tek hücreli embriyoların kriyopreservation için geliştirilmiş bir yöntem sıyoruz. Optimize elektroporasyon koşulları ile birleştirerek, bu protokol kısa bir süre içinde yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranları ile nakavt ve knock-in farelerin üretimi için izin verir. Ayrıca, CRISPR reaktif hazırlama, in vitro fertilizasyon, kriyopreservation ve tek hücreli embriyoların çözülmesi, CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonu, fare üretimi ve kurucuların genotiplemesini kapsayan optimize edilmiş protokolümüzün adım adım açıklamasını gösteriyoruz. Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar benzersiz bir kolaylık, hız ve verimlilik ile GM fareler hazırlamak gerekir.
Introduction
Kümelenmiş düzenli olarak uzaydan kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) sistemi genom1’debenzeri görülmemiş hedefli modifikasyon sağlayan bilimsel bir atılımdır. CRISPR/Cas9 sistemi Cas9 proteinve kılavuz RNA (gRNA) iki moleküler bileşenden oluşur: hedefe özel CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive CRISPR RNA (tracrRNA)2. Bir gRNA, Cas9 proteinini genomdaki spesifik lokusa, crRNA’ya bitişik 20 nükleotite ve protospacer bitişik motifine (PAM) yönlendirir. Cas9 proteini hedef sıraya bağlanır ve hatayatkın olmayan homolog uç birleştirme (NHEJ) veya yüksek sadakat homoloji yönelimli onarım (HDR)3,4,5tarafından onarılır çift iplikçikli sonları (DSBs) indükler. NHEJ eklemelere veya/ve silmelere (indels) ve dolayısıyla bir kodlama dizisi hedeflendiğinde gen kaybına yol açar. HDR homoloji dizileri içeren bir onarım şablonu varlığında hassas genom düzenleme yol açar3,4,5. NHEJ ve HDR sırasıyla nakavt ve nakavt fareler üretmek için harnessed edilmiştir.
CRISPR/Cas9 sistemi olağanüstü etkinlik ve sadakatle GM farelerinin neslini belirgin bir şekilde hızlandırmış olsa da, bu yöntemleri uygulayan bilim adamları genellikle teknik zorluklarla karşılaşır. İlk olarak, konvansiyonel protokoller döllenmişyumurta6,7pronükleus içine CRISPR düzenleme araçları tanıtmak için mikroenjeksiyon gerektirir. Bu teknik zaman alıcıdır ve genellikle kapsamlı bir eğitim gerektirir. Böylece, çeşitli gruplar elektroporasyon8ilemikroenjeksiyon yerine 8 ,9,10,11,12,13. Ancak, erken elektroporasyon protokollerinde elektroporasyon için taze embriyolar kullanılmıştır. Her deney den önce taze embriyo hazırlama zor olduğu için bu, başka bir soruna nedenoldu 14.
Son zamanlarda biz ve diğerleri gmfarelerinüretimini kolaylaştıran genom düzenleme için dondurulmuş çözülmüş embriyolar ve elektroporasyon kullanımı kombine ettik15 ,16. Bu protokol, gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların hızla yüksek verimlilik ile insan hastalıklarının hayvan modelleri oluşturmak için olanak sağlar. Protokol aynı zamanda önemli ölçüde kurucuları16genetik heterojenlik gibi GM fareler, üreten pratik zorlukları azaltır. Mozaiğiaşmak için, embriyo erimesinden sonra 1 saat içinde CRISPR reaktiflerinin elektroporasyonunu gerçekleştiriyoruz ve düzenlemenin genomun ilk replikasyonundan önce gerçekleşmesini sağlıyoruz. Başka bir gelişme istenmeyen mozaikazaltmak için Cas9 mRNA yerine Cas9 protein kullanımı içerir17. Ayrıca, tek hücreli embriyo kriyopreservation için optimal bir yöntem geliştirdik bu iki hücreli evre için gelişim hızını artırır16: fetal sığır serumu kullanımı (FBS) önemli ölçüde döllenme sonrası donma çözülmüş oositlerin hayatta kalma artırır, belki de donma çözülmüş unfertilized oositler daha esnek kılan aynı mekanizma ile18.
Burada tek hücreli C57BL/6J embriyoların kriyopreservation için modifiye yöntemi de dahil olmak üzere, dondurulmuş çözülmüş embriyolar kullanarak GM farelerin üretimi için kapsamlı bir protokol sıyoruz. Bu içerir 1) gRNA tasarım, CRISPR reaktif hazırlama ve montaj; 2) TEK hücreli embriyoların ivf, kriyoprezervasyon ve erime; 3) CRISPR reaktiflerinin dondurulmuş embriyolara elektroporasyonu; 4) Embriyo transferi sözde hamile dişi farelerin oviduct içine; ve 5) F0’nin kurucu hayvanlarının genotipleme ve dizi analizi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol, yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranlarıile GM farelerin üretimine olanak sağlar(Tablo 1). Gelişmiş embriyo manipülasyon becerileri olmadan araştırmacıların mutant fareleri kolayca yaratmalarını sağlar, çünkü hem üreme mühendisliği hem de genom düzenleme teknolojilerinde en son ve en yararlı gelişmelerden yararlanır: CRISPR/Cas9 ribonükleoprotein (RNP) ve dondurulmuş çözülmüş embriyolara elektroporasyon. Bu gelişmeler GM farelerin neslini kolayla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hitomi Sawada ve Elizabeth Garcia’ya hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ve 16K01946) ve Hokugin Research Grant (H.N.’ye) ve Jichi Medical University Genç Araştırmacı Ödülü (H.U.’ya) tarafından desteklenmiştir. Otsuka Toshimi Burs Vakfı, Yüksek Angeles’ı destekledi.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 发育生物学. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. 遗传学. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. 发育生物学. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. 生物工程. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
