Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen
Summary
Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.
Abstract
Die Verwendung von gentechnisch veränderten (GV) Mäusen ist entscheidend für das Verständnis der Genfunktion und die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Mechanismen menschlicher Krankheiten geworden. Das CRISPR/Cas9-System ermöglicht es Forschern, das Genom mit beispielloser Effizienz, Genauigkeit und Einfachheit zu modifizieren. Mit dieser Technologie suchen Forscher nach einem schnellen, effizienten und einfachen Protokoll zur Erzeugung von GV-Mäusen. Hier führen wir eine verbesserte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen ein, die zu einer höheren Entwicklungsrate der gefrierenden Embryonen führt. Durch die Kombination mit optimierten Elektroporationsbedingungen ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von Knockout- und Knock-in-Mäusen mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten innerhalb kurzer Zeit. Darüber hinaus zeigen wir eine schritt weise Erklärung unseres optimierten Protokolls, das die CRISPR-Reagenzpräparation, In-vitro-Fertilisation, Kryokonservierung und das Auftauen von einzelligen Embryonen, die Elektroporation von CRISPR-Reagenzien, die Mausgenerierung und die Genotypisierung der Gründer umfasst. Mit diesem Protokoll sollten Forscher in der Lage sein, gentechnisch veränderte Mäuse mit beispielloser Leichtigkeit, Geschwindigkeit und Effizienz vorzubereiten.
Introduction
Das gruppierte, regelmäßig interspaceierte kurzpalädime Wiederholungen (CRISPR)/CRISPR-assoziiertes Protein 9 (Cas9) System ist ein wissenschaftlicher Durchbruch, der eine beispiellose gezielte Modifikation im Genom1ermöglicht. Das CRISPR/Cas9-System besteht aus Cas9-Protein und Guide-RNA (gRNA) mit zwei molekularen Komponenten: einer zielspezifischen CRISPR-RNA (crRNA) und einer transaktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA)2 . Eine gRNA leitet das Cas9-Protein auf den spezifischen Ort im Genom, 20 Nukleotide, die crRNA ergänzen, und neben dem protospacer angrenzenden Motiv (PAM). Das Cas9-Protein bindet an die Zielsequenz und induziert Doppelstrangbrüche (DSBs), die entweder durch fehleranfällige nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder High-Fidelity-Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR)3,4,5repariert werden. Das NHEJ führt zu Einfügungen oder/und Deletionen (Indels) und damit zu einem Genverlust der Funktion, wenn eine Codierungssequenz angepeilt wird. Die HDR führt zu einer präzisen Genombearbeitung in Gegenwart einer Reparaturvorlage, die Homologiesequenzen3,4,5enthält. Die NHEJ und HDR wurden genutzt, um Knockout- bzw. Knock-in-Mäuse zu erzeugen.
Während das CRISPR/Cas9-System die Erzeugung von GV-Mäusen mit herausragender Wirksamkeit und Genauigkeit deutlich beschleunigt hat, stehen Wissenschaftler, die diese Methoden anwenden, oft vor technischen Herausforderungen. Erstens erfordern herkömmliche Protokolle eine Mikroinjektion für die Einführung der CRISPR-Bearbeitungswerkzeuge in den Vorkern befruchteter Eier6,7. Diese Technik ist zeitaufwändig und erfordert in der Regel eine umfangreiche Schulung. So ersetzten mehrere Gruppen die Mikroinjektion durch Elektroporation8,9,10,11,12,13. In den frühen Elektroporationsprotokollen wurden jedoch frische Embryonen für die Elektroporation verwendet. Dies verursachte ein weiteres Problem, denn die Vorbereitung frischer Embryonen vor jedem Experiment ist schwierig14.
Kürzlich haben wir und andere die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die Genombearbeitung kombiniert, was die Erzeugung von GV-Mäusen15,16erleichtert. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern ohne fortgeschrittene Embryo-Manipulationsfähigkeiten, schnell Tiermodelle menschlicher Krankheiten mit hoher Effizienz zu generieren. Das Protokoll reduziert auch die praktischen Herausforderungen bei der Erzeugung von GV-Mäusen, wie z. B. genetische Heterogenität in den Gründern16. Um den Mosaikismus zu überwinden, führen wir die Elektroporation von CRISPR-Reagenzien innerhalb von 1 h nach dem Auftauen des Embryos durch, um sicherzustellen, dass die Bearbeitung vor der ersten Replikation des Genoms erfolgt. Eine weitere Verbesserung beinhaltet die Verwendung von Cas9-Protein anstelle von Cas9 mRNA, um unerwünschten Mosaikismus zu reduzieren17. Darüber hinaus haben wir eine optimale Methode für die Einzell-Embryo-Kryokonservierung entwickelt, die die Entwicklungsrate auf das Zweizellstadium16erhöht: Die Verwendung von fetalem Rinderserum (FBS) verbessert das Überleben gefriergetauter Eizellen nach der Befruchtung dramatisch, vielleicht durch denselben Mechanismus, der gefriertaute unbefruchtete Eizellen widerstandsfähiger macht18.
Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Erzeugung von gentechnisch veränderten Mäusen mit gefriergetgetgetatten Embryonen vor, einschließlich der modifizierten Methode zur Kryokonservierung von einzelligen C57BL/6J-Embryonen. Es umfasst 1) gRNA-Design, CRISPR-Reagenzvorbereitung und -montage; 2) IVF, Kryokonservierung und Auftauen von Einzell-Embryonen; 3) Elektroporation von CRISPR-Reagenzien in gefriergettaute Embryonen; 4) Embryotransfer in das Eileiter von pseudoschwangeren weiblichen Mäusen; und 5) Genotypisierung und Sequenzanalyse der F0-Gründertiere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Erzeugung von GV-Mäusen mit hoher Effizienz und niedrigen Mosaikraten (Tabelle 1). Es ermöglicht Forschern ohne fortgeschrittene Embryo-Manipulationsfähigkeiten, mutierte Mäuse leicht zu erstellen, da sie die neuesten und nützlichsten Fortschritte sowohl in der Reproduktionstechnik als auch in den Genom-Editing-Technologien nutzen: CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein (RNP) und Elektroporation in gefriergettaute Embryonen. Diese Fortschritte erleichterten und besc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Hitomi Sawada und Elizabeth Garcia für die Tierpflege. Diese Arbeit wurde von KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 und 16K01946) und Hokugin Research Grant (an H.N.) und Jichi Medical University Young Investigator Award (nach H.U.) unterstützt. Die Otsuka Toshimi Scholarship Foundation unterstützte M.D.
Materials
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
References
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA – guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-822 (2012).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. 发育生物学. 393 (1), 3-9 (2014).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. 遗传学. 200 (2), 423-430 (2015).
- Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).
- Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. 发育生物学. 418 (1), 1-9 (2016).
- Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. 生物工程. 6 (3), 63 (2019).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
- Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).
- Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).
- Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).
- Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
- Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).
- Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
- Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
