Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Reinigung polymorphonuklearer Leukozyten aus ganzem menschlichen Blut und zwei verschiedene Assays, die die Zytotoxizität von Staphylococcus aureus gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen quantifizieren.
Staphylococcus aureus ist in der Lage, eine breite Palette von Leukoziden zu seften, die auf die Membranintegrität polymorphonukleanischer Leukozyten (PMNs oder Neutrophilen) abzielen und diese stören. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die Reinigung menschlicher PMNs als auch die Quantifizierung der S. aureus-Zytotoxizität gegen PMNs in drei verschiedenen Abschnitten. Abschnitt 1 beschreibt die Isolierung von PMNs und Serum aus menschlichem Blut mittels Dichtezentrifugation. Abschnitt 2 testet die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen, die von S. aureus produziert werden, gegen diese gereinigten menschlichen PMNs. Abschnitt 3 misst die Zytotoxizität gegen humane PMNs nach der Phagozytose des lebenden S. aureus. Diese Verfahren messen die Störung der PMN-Plasmamembranintegrität durch S. aureus Leukocidine mithilfe der Durchflusszytometrieanalyse von PMNs, die mit Propidiumiodid behandelt werden, einem DNA-bindenden Fluorophor, das zellmembrane undurchlässig ist. Zusammengenommen haben diese Methoden den Vorteil, dass S. aureus Cytotoxizität schnell gegen primäre humane PMNs getestet wird und können leicht angepasst werden, um andere Aspekte von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen.
Staphylococcus aureus ist ein grampositives Bakterium, das beim Menschen ein breites Spektrum an Krankheiten verursacht. Dieser prominente Erreger produziert zahlreiche Virulenzfaktoren, die zu verschiedenen Aspekten der Infektion beitragen. Dazu gehören Oberflächenmoleküle, die es S. aureus ermöglichen, an verschiedenen Arten von Wirtsgewebehaften 1, extrazelluläre Proteine, die mit der Wirtsimmunantwort stören2, und eine Reihe von abgesonderten Toxinen, die verschiedene Arten von Wirtszellen 3 . In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode, die die Zytotoxizität von extrazellulären Proteinen quantifiziert, die von S. aureus gegen menschliche polymorphonukleare Leukozyten (PMNs oder Neutrophile), primäre Effektorzellen des Angeborenen der Immunantwort des Wirts, produziert werden.
PMNs sind die häufigsten Leukozyten bei Säugetieren. Diese zirkulierenden Immunzellen werden schnell an die Stelle der Wirtsgewebe Beleidigung als Reaktion auf Gefahrensignale von ansässigen Zellen oder von Verbindungen einzigartig für eindringende Mikroben rekrutiert. Die extrazelluläre Eingabe dieser Moleküle und aus direkten Kontakten mit aktivierten ansässigen Wirtszellen während der Extravasation erhöhen den Aktivierungszustand von PMNs in einem Prozess, der als Priming4,5bekannt ist. Primed PMNs, die beunruhigtes Gewebe erreicht haben, führen dann wichtige angeborene Immunantworten aus, die die Etablierung einer Infektion verhindern sollen. Dazu gehören die Bindung und Internalisierung, oder Phagozytose, von eindringenden Mikroorganismen, die eine Kaskade von intrazellulären Ereignissen auslösen, die in der Mikrobenzerstörung durch eine Batterie von potenten antimikrobiellen Verbindungen kumulieren5.
PMNs spielen eine wesentliche Rolle zum Schutz des Menschen vor eindringenden Krankheitserregern und sind besonders wichtig, um eine S. aureus-Infektion zu verhindern4. Dieses Bakterium produziert jedoch eine breite Palette von Virulenzgenen, die verschiedene PMN-Funktionen behindern. Dazu gehören extrazelluläre Proteine, die die Erkennung von Signalmolekülen blockieren, die Haftung an Wirtsgewebe verhindern, die Produktion antimikrobieller Verbindungen hemmen und die Integrität der Plasmamembran beeinträchtigen4. S. aureus orchestriert die zeitliche Expression dieser Virulenzgene durch den kollektiven Input mehrerer zweikomponentischer sensorischer Systeme, die spezifische Umwelthinweise erkennen. Das SaeR/S Zweikomponentensystem ist ein wichtiger Aufregulator der S. aureus Virulenz-Gentranskription während der Infektion6,7,8,9,10,11. Insbesondere hat sich dieses Zweikomponentensystem als entscheidend für die Herstellung von Zweikomponenten-Leukocidinen erwiesen, die speziell auf menschliche PMNsabzielen 12.
Dieses Protokoll ist in drei verschiedene Abschnitte unterteilt. Der erste Abschnitt beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation mit einem Protokoll, das an methoden angepasst wurde, die von B’yum13 und Nauseef14festgelegt wurden. Der zweite und dritte Abschnitt beschreiben zwei verschiedene Techniken zur Untersuchung der Zytotoxizität von S. aureus; eine berauscht PMNs mit extrazellulären Proteinen, die von S. aureus produziert werden, während der andere die Fähigkeit lebender Bakterien untersucht, PMNs nach Phagozytose zu schädigen. Bei diesen Verfahren wird Propidiumjodid verwendet, um den Verlust der PMN-Plasmamembranintegrität zu messen, der durch S. aureus porebildende Toxine verursacht wird. Propidiumiodid ist ein DNA-bindendes Fluorophor, das normalerweise zellmembranen undurchlässig ist, aber Plasmamembranen kreuzen kann, die durch S. aureus Toxine gestört wurden. Die Durchflusszytometrie-Analyse ermöglicht die schnelle Quantifizierung von propidiumiodid-positiven PMNs, um die relative Zytotoxizität von S. aureus-Stämmen zu messen. Methicillin-resistenter S. aureus (MRSA), der als gepulste Gelelektrophorese typ USA300 identifiziert wurde, und ein isogenes Deletionsmutant von saeR/S in diesem Stamm (USA300′saeR/S) wurden als Modelle verwendet, um zu demonstrieren, wie diese Verfahren die Zytotoxizität von S. aureus gegenüber menschlichen PMNs quantifizieren können.
Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung von PMNs aus menschlichem Blut und zwei verschiedene Assays, die Propidiumjodid zur Quantifizierung der Zytotoxizität von S. aureus gegen diese wichtigen angeborenen Immunzellen verwenden. Der Erfolg dieser Verfahren hängt von der Qualität der gereinigten PMNs und der geeigneten Herstellung von S. aureus und extrazellulären Proteinen ab, die von diesem Erreger produziert werden. Für die Isolierung von PMNs ist es wichtig, die PMN-Aktivierung während und nach der Reinigung zu minimieren, indem Reagenzien frei von Endotoxinkontamination verwendet werden, Zellpräparate schonend behandelt und Zellen bei der entsprechenden Temperatur gehalten werden. Anzeichen, die auf die Aktivierung von PMNs hinweisen, sind das Verklumpen von Zellen während der Reinigung und wenn mehr als 5% der isolierten Zellen positiv für Propidiumjodid färben. Aufgrund der relativ kurzen Lebensdauer von PMNs müssen diese Zellen aus menschlichem Blut isoliert und am selben Tag getestet werden. PMNs werden beginnen, Anzeichen einer spontanen Apoptose zu zeigen, wenn sie nach der Reinigung mehr als 3 h auf Eis gelassen werden. Wie bereits erwähnt, ist es sehr wichtig, dass jedes PMN-Präparat sorgfältig mit der Durchflusszytometrieanalyse der Vorwärts- und Seitenstreuung sowie der Propidiumjodidfärbung bewertet wird, um die Reinheit und Integrität isolierter Zellen zu gewährleisten.
Die Expression von Zweikomponenten-Leukocidinen durch S. aureus ist verantwortlich für die Mehrheit der kompromittierten PMN-Plasmamembranintegrität, die mit den in diesem Protokoll beschriebenen Assays beobachtet wird. Variationen in der Expression dieser Toxine und anderer porenbildender Peptide, wie phenollösliche Module, zwischen S. aureus-Stämmen führen zu Unterschieden in der Zytotoxizität gegenüber menschlichen PMNs. Signifikante Abweichungen während des In-vitro-Wachstums zwischen S. aureus-Stämmen beeinflussen auch die Expression von porenbildenden Toxinen und die anschließende Zytotoxizität. Darüber hinaus hat das Verhältnis von S. aureus zu PMNs in phagozytose-Assays einen großen Einfluss auf die nachfolgende PMN-Plasmamembrandurchlässigkeit (Abbildung 3A), und diese Experimente erfordern die konsistente Ernte gleicher Konzentrationen jedes S. aureus-Stamms, der in der mittelexponentiellen Wachstumsphase mit den OD600 subkultivierter Bakterien getestet wurde. Angesichts dieser Überlegungen ist es sehr wichtig, Wachstumskurven für alle Stämme zu definieren, die vor Beginn der Zytotoxizitätstests untersucht werden. Wir empfehlen diese Methoden zur Analyse der S. aureus Zytotoxizität mit Stämmen, die signifikante Wachstumsunterschiede in vitro aufweisen.
USA300 ist ein virulentes MRSA-Isolat, das bekanntermaßen hochzytoxisch gegen humane PMNs15 ist, und der Verlust von SaeR/S in diesem Stamm reduziert die Transkription zahlreicher Bi-Komponenten-Leukocidine, die auf humane PMNs6,12abzielen, was diese Stämme zu idealen Modellen für den Vergleich der Zytotoxizität mit den beschriebenen Assays macht. Es gibt jedoch umfangreiche genetische Unterschiede zwischen verschiedenen S. aureus Isolaten und die in diesen Protokollen beschriebenen Parameter können bei der Prüfung anderer S. aureus-Stämme nicht zu wesentlichen Veränderungen der Zytotoxizität gegenüber menschlichen PMNführen führen. Die Anpassung der Wachstumsbedingungen, der zugesetzten Überstände oder des Verhältnisses von Bakterien zu PMNs kann für den Erfolg mit diesen Methoden mit anderen Stämmen von S. aureuserforderlich sein.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den U.S. National Institutes of Health Grants NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 sowie Mitteln der Montana State University Agriculture Experiment Station und einem Ausrüstungsstipendium des Murdock Charitable Trust unterstützt. .
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |