Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Nelle prime fasi di sviluppo, i pool di cellule progenitrici specializzate si dividono ripetutamente in zone proliferanti, producendo diverse matrici di cellule figlie. Le cellule nate durante questo periodo di sviluppo si differenziano e viaggiano per formare gli organi nascenti. Nel sistema nervoso, progenitori come la glia radiale danno origine a neuroni immaturi in zone ventricolari. Come i neuroni migrano lontano dai ventricoli e matura, il tessuto in espansione alla fine forma le strutture altamente complesse del cervello^1,2,3,4,5,6. Il coordinamento tra la divisione dei progenitori e la differenziazione e la migrazione dei neuroni determinerà la dimensione, la forma e quindi la funzione del cervello, influenzando direttamente il comportamento^7,8,9,10. Mentre uno stretto controllo su questi processi è chiaramente cruciale per il normale sviluppo del cervello, i meccanismi globali che regolano queste dinamiche non sono ben compresi. Qui descriviamo uno strumento per studiare lo sviluppo del sistema nervoso a una risoluzione cellulare, permettendo ai ricercatori di visualizzare le cellule progenitrici e neuroni in vivo nel cervello di pesce zebra in via sviluppo con Brainbow e monitorare il loro comportamento nel tempo attraverso la microscopia confocale time-lapse¹¹. L’approccio può anche essere adattato per visualizzare altre parti dell’embrione in via di sviluppo.

Per osservare e distinguere tra le cellule nel cervello del pesce zebra in via di sviluppo, abbiamo adattato la tecnica di etichettatura delle cellule di Brainbow¹¹. Brainbow utilizza l’espressione combinatoria determinata casualmente di tre distinte proteine fluorescenti (FP) per etichettare una popolazione di cellule. Mentre l’espressione predefinita per l’espressione Brainbow è il rosso FP dTomato, la ricombinazione da parte dell’enzima Cre ricombinasi risultati in espressione di mCerulean (proteina fluorescente ciana, CFP) o proteina fluorescente gialla (YFP)^12,13. La quantità combinata di ogni FP espresso in una cella gli conferisce una tonalità unica, consentendo una chiara distinzione visiva dalle celle vicine. Inoltre, quando una cellula progenitrice si divide, ogni cellula figlia erediterà il colore dalla sua cellula madre, producendo cloni codificati a colori e permettendo ai ricercatori di tracciare il lignaggio cellulare^11,14. Mentre originariamente utilizzato per analizzare i circuiti neuronali nei topi¹², Brainbow è stato da allora espresso in una vasta gamma di organismi modello, tra cui il pesce zebra¹⁵.

La nostra tecnica si basa su precedenti metodi di etichettatura e imaging multicolore per creare direttamente più cloni codificati a colori nel tempo nel pesce zebra vivente. Grazie alla loro trasparenza ottica come embrioni, i pesci zebra sono adatti agli esperimenti di imaging¹⁶, e studi precedenti hanno utilizzato Brainbow nel pesce zebra per studiare una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. La capacità di immagine direttamente nell’organismo vivente, insieme al loro rapido sviluppo ex utero, rendono il pesce zebra un prezioso modello di sviluppo dei vertebrati. A differenza del cervello dei mammiferi, l’intera zona proliferare del cervello posteriore del pesce zebra è prontamente disponibile per l’imaging senza interruzioni al suo ambiente endogeno⁶. Ciò consente di condurre esperimenti nell’organismo vivente, piuttosto che in preparati in vitro o in tessuto fisso. A differenza degli esperimenti di imaging fissi, gli studi in vivo consentono una progettazione longitudinale, producendo ore di dati che possono essere analizzati per modelli, aumentando così la probabilità di osservare eventi relativamente rari. A seconda della velocità e della durata degli eventi di interesse, i ricercatori possono scegliere di eseguire brevi (1–2 h) o lunghi (fino a 16 h) esperimenti di imaging time-lapse. Utilizzando il promotore di scosse di calore di pesce zebra 70 (hsp70, hsp), espressione Brainbow può essere controllato temporalmente^28,29. Inoltre, l’espressione mosaico indotta da questo promotore è adatta per etichettare e tracciare molti cloni¹¹.

La capacità di identificare visivamente più cloni all’interno del cervello vivente è un vantaggio di questo metodo. Importanti studi precedenti che hanno studiato il ruolo dei cloni all’interno dello sviluppo del sistema nervoso utilizzavano vettori retrovirali per etichettare una singola cellula progenitrice e la sua progenie utilizzando un singolo FP o altra proteina facilmente visualizzabile. Tale etichettatura consente ai ricercatori di osservare un singolo clone nel tempo, sia in vitro che in vivo^{2,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. In contrasto con i metodi per monitorare il comportamento delle cellule all’interno di un clone, i colori distinti di Brainbow consentono ai ricercatori di osservare la dinamica tra i cloni. Inoltre, utilizzando Brainbow per etichettare molti cloni all’interno del cervello, vengono raccolti dati aggiuntivi sul comportamento clonale rispetto alle tecniche che etichettano un singolo clone¹¹. È importante sottolineare che gli approcci qui descritti possono essere ampliati per generare confronti di sviluppo tra pesci che hanno subito diverse manipolazioni genetiche o farmacologiche¹⁸. Nel complesso, questi vantaggi rendono l’imaging confocale in vivo in vivo del pesce zebra che esprime Barcobaleno ideale per i ricercatori che esplorano lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati, in particolare quelli interessati al ruolo dei cloni.